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上样缓冲液前沿信息_上样缓冲液和loading buffer(2024年11月实时热点)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：教程更新日期：2024-11-27

上样缓冲液

WB蛋白上样缓冲液怎么用

SDS-PAGE电泳：操作指南 𐟔찟”찟”젒IPA裂解缓冲液：25 mM Tris-HCl pH 7.6；150 mM NaCl；5 mM EDTA；1% Triton X-100；1% 十二烷基硫酸钠（SDS）；0.1% 脱氧胆酸钠；1 mM PMSF 𐟧𙠦“作注意事项： 1️⃣ 玻璃板清洗：先用自来水彻底清洗两面，再用蒸馏水冲洗干净，确保玻璃板中没有杂质。清洗后立在筐里晾干或烘箱中烘干。 2️⃣ 配胶操作：必须在通风橱中进行。 3️⃣ 封胶与吸水：加入水或无水乙醇后建议关闭通风，吸水或无水乙醇后，建议通风吹10分钟左右。 4️⃣ 灌胶技巧：避免胶板内出现气泡。 5️⃣ 上样过程：避免样品溢出或进入其他泳道。 6️⃣ 空泳道处理：可以加入5上样缓冲液，防止相邻泳道扩散至空泳道。 7️⃣ 毒性提示：丙烯酰胺（Acrylamide）有毒性，TEMED有腐蚀性和挥发性，APS对皮肤黏膜有刺激性和腐蚀性，SDS对黏膜、上呼吸道、眼和皮肤有刺激作用，蛋白loading buffer也有毒性。 8️⃣ 加入顺序：30%Acr和TEMED建议放在倒数第二和第一的位置加入。 𐟓 操作步骤：清洗玻璃板在通风橱中配胶灌胶并避免气泡上样并防止样品溢出处理空泳道 𐟚렦𓨦„事项：丙烯酰胺（Acrylamide）有毒性 TEMED有腐蚀性和挥发性 APS对皮肤黏膜有刺激性和腐蚀性 SDS对黏膜、上呼吸道、眼和皮肤有刺激作用蛋白loading buffer有毒性 𐟓‹ 操作技巧：清洗玻璃板时要彻底，确保没有杂质。配胶时要在通风橱中进行，注意安全。灌胶时要小心，避免气泡产生。上样时要避免样品溢出，确保样品均匀分布。处理空泳道时可以加入上样缓冲液，防止扩散。 𐟔찟”찟”젥ꌦ“作时，请务必注意安全，遵守实验室规定，确保实验顺利进行。

穷人的劳斯莱斯：WB实验指南心𐟉！大家好，今天我想和大家分享一些关于WB（Western Blot）实验的心得，希望对正在做实验的你们有所帮助。虽然这些技巧可能看起来很简单，但它们是我多年实验经验的总结，希望能帮助你们少走弯路。配胶小贴士 𐟧ꊩ斥…ˆ，配胶这一步非常关键。你需要确保凝胶配制时所有的试剂都是新鲜的，特别是过硫酸铵（AP）和TEMED。如果凝胶出现花纹，可能是AP受潮了，检查一下吧。另外，凝胶聚合时间通常在30分钟左右，如果聚合得太慢，可能是AP不新鲜或者环境温度太低。这时，你可以适当增加AP和TEMED的量，但一般不要超过1小时。如果超过1小时还没聚合好，那就要检查你的操作了。处理蛋白样品 𐟥抨›‹白样品的质量直接影响实验结果。如果你发现蛋白提取有问题或者蛋白降解了，那实验肯定做不好。另外，loading buffer也很重要，不要用不新鲜的上样缓冲液。处理样品时，一定要把样品和loading buffer混合均匀。电泳技巧 𐟏Š‍♂️ 跑积层胶时，尽量让样品压齐。如果上样量较大（比如细胞蛋白通常上样在20-30甚至40ul），可以适当减小电压跑20-30分钟，等样品压齐后再开始分离。转膜环节 𐟔„ 转膜的成功与否决定了实验能否顺利进行。电流大小和转膜时间要根据目标蛋白的分子量来定。我个人的经验是：10KDa的蛋白用200mA转1小时，60KDa的蛋白用70V转2小时，90KDa的蛋白用70V转4小时，200KDa的蛋白用70V转6小时。封闭步骤 𐟚ꊥ𐁩—�™一步一般不容易出错，常见的做法是在室温下封闭2-3小时，或者4度封闭过夜。不过要注意，有些抗体需要特殊的封闭液。一抗孵育 𐟦 新抗体使用时，按照说明书推荐的浓度在室温孵育2-3小时。如果抗体效果不好，可以尝试延长孵育时间（比如4度过夜孵育甚至室温过夜孵育），或者增大抗体浓度。如果尝试了所有方法还是不行，建议换抗体。洗膜 𐟌Š 洗膜液洗3遍，每遍10分钟就够了。洗膜时间过长或者次数过多反而不好，膜的背景不好很多时候不是没洗干净，而是抗体浓度过高或者其他原因。二抗孵育 𐟦‹ 选择好一个合适的条件后不要轻易改变。相比一抗，二抗的作用时间要严格控制。实践证明，一抗时间长点可能没关系，但二抗时间过长或过短都会影响结果。希望这些小贴士能帮到你们，祝大家实验顺利！𐟒ꀀ

tricine小分子蛋白电泳在进行低分子量蛋白（2.5-40 kD）分离时，Tricine胶（Tricine-SDS-PAGE）是一种常用的电泳方法。雅酶的Tricine配胶试剂盒在以下几个方面具有显著优势： 𐟔„ 简易的配胶过程：雅酶的Tricine配胶试剂盒只需简单混合即可，无需添加TEMED，促凝剂为液体，上层胶为彩色，便于上样。而市面上大多数品牌的配胶组分复杂，需要添加TEMED，促凝剂为固体，需要自行配成液体，且保质期较短。 𐟔砤𞿦𗧚„上样体验：雅酶试剂盒配套赠送蛋白上样缓冲液和考马斯亮蓝快速染液（免脱色），而市面上其他品牌通常需要额外购买这些组件。 𐟔砧𛟤𘀧š„电泳液：雅酶的电泳液不分阴极和阳极，只有一瓶，而其他品牌通常分为两瓶，分别对应阴极和阳极。通过这些特点，雅酶的Tricine配胶试剂盒为用户提供了更加便捷和高效的实验体验。

WB缓冲液配方大全，实验必备！ 𐟓– 上样缓冲液 SDS 上样缓冲液（Laemmli 缓冲液）：63 mM Tris-HCl、10% 甘油、2% SDS、0.0025% 溴酚蓝，pH 6.8 𐟓‘ 2X 储存液配方 LDS上样缓冲液：106 mM Tris-HCl、141 mM Tris base、2% LDS、10% 甘油、0.51 mM EDTA、0.22 mM SERVA Blue G250、0.175 mM 酚红，pH 8.5 𐟓˜ 4X 储存液配方电泳缓冲液 Tris- 甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：25 mM Tris base、192 mM 甘氨酸、0.1% SDS，pH 8.3 Tris- 甘氨酸非变性电泳缓冲液：25 mM Tris base、192 mM 甘氨酸，pH 8.3 MOPS SDS 电泳缓冲液：50 mM MOPS、50 mM Tris base、0.1% SDS、1 mM EDTA，pH 7.7 MES SDS 电泳缓冲液：50 mM MES、50 mM Tris base、0.1% SDS、1 mM EDTA，pH 7.3 Tricine SDS 电泳缓冲液：100 mM Tris base、100 mM tricine、0.1% SDS，pH 8.3 𐟓 转印缓冲液 Tris-甘氨酸转印缓冲液：12 mM Tris base、96 mM 甘氨酸， pH 8.3 Bis-Tris 转印缓冲液：25 mM bicine、25 mM Bis-Tris（游离碱）、1 mM EDTA，pH 7.2 这些配方是进行WB实验时常用的缓冲液配方，根据实验需求选择合适的缓冲液，以确保实验结果的准确性。

上样缓冲液揭秘：蛋白跑得快！无论你是通过什么方法获得蛋白质样本，也不管它的最终用途是什么，你都需要将它与一种溶液混合，使其与SDS-PAGE兼容。这种溶液就是上样缓冲液（Laemmli buffer）。接下来，我来详细介绍一下上样缓冲液的组成成分以及它们的作用。 SDS：让蛋白质变性的魔法师 𐟧™‍♂️ SDS是一种广为人知的去污剂，主要用于使蛋白质变性。它通过破坏非共价键来破坏蛋白质二级和四级结构的稳定性。在SDS-PAGE中，变性的蛋白质至关重要。此外，SDS还能在蛋白质样品上调整净负电荷，使其在SDS-PAGE实验中向同一方向迁移。还原剂：打破共价键 𐟔劦œ‰些四级结构是通过二硫键结合在一起的。由于它们是共价键，SDS无法将它们破坏，因此需要一种特定的染料来将它们分开。加入还原剂，例如beta巯基乙醇或者DTT等，可以打破这些二硫键。 Tris：保持pH值稳定 𐟌᯸ Tris的作用是维持6.8的pH值，使上样缓冲液保持化学稳定。Tris能阻止多种酶的活性，因此能防止蛋白酶降解分析物。将上样缓冲液pH值调至6.8，有助于实现SDS-PAGE的最大分辨率。6.8也接近甘氨酸的等电点（pI 4.0），而SDS-PAGE电泳缓冲液使用的是三甘氨酸缓冲液体系。甘油：让样品沉下去 𐟌Š 甘油的密度比水大。在你的上样缓冲液-样品混合物中充分混合，整个溶液的密度就会比水大。因此，当混合物被加到SDS-PAGE凝胶泳道上时，它就会下沉。染料：显示样品的位置 𐟎芥œ覸𘧦𛧼“冲液中加入一种染料（通常是溴酚蓝），可以让我们在将样品加入SDS-PAGE凝胶时显示出样品。严格来说，这并不是必须的。染料分子在凝胶中的迁移速度比蛋白质分析物要快得多。实际上，所有染料分子都会一起迁移到一个叫做“染料前沿”的边界，就是我们电泳时常看到跑在最前面的那条细线。所以，只要染料前沿还在凝胶上，我们就可以确信，即使是最轻的分析物也能保留在凝胶上。保存与使用小贴士 𐟓„ 浓缩的上样缓冲液可以在4 Ⰳ下保存一年而不用担心其效果。如果没有beta巯基乙醇，可以用DTT代替，但每次使用后都要重新添加，因为它不如beta巯基乙醇稳定。通过这些成分的巧妙组合，上样缓冲液能够让你的蛋白质样本在SDS-PAGE中跑得又快又稳，为你的实验结果打下坚实的基础！

SDS-PAGE缓冲液，简单配方！在进行SDS-PAGE电泳时，使用合适的上样缓冲液至关重要。以下是一个简单而有效的5xSDS-PAGE Loading Buffer的配方，帮助你更好地分离和可视化蛋白质。 𐟓 配方组分： 250mM Tris-HCl（pH 6.8） 10%（W/V） SDS 0.5%（W/V） BPB 50%（V/V）甘油 5%（W/V） 巯基乙醇 𐟔젩…制步骤：将1.25mL 1M Tris-HCl、0.5g SDS、25mg BPB和2.5mL甘油混合在10mL塑料离心管中。加入去离子水，搅拌至完全溶解，然后定容至5mL。将混合物分装成500的小份，室温保存。使用前，向每小份中加入25的2-ME，并搅拌均匀。加入2-ME的Loading Buffer可以在室温下保存一个月左右。 𐟓 注意事项：确保所有试剂都是新鲜的，并且没有受到污染。在使用前，检查所有试剂的浓度和纯度。通过以上步骤，你可以轻松制备出高质量的SDS-PAGE上样缓冲液，为你的蛋白质研究提供有力的支持。

SDS-PAGE电泳及转膜全攻略一、制胶确定蛋白分子量，选择合适的SDS-PAGE胶浓度，并准备好灌胶模具。分离胶的配置：按照配方加入试剂并混匀，过硫酸铵现配现用。缓慢倒入模具，覆盖乙醇液封，等待10-20分钟。分离胶和乙醇层出现清晰界面时，倒掉乙醇。浓缩胶的配置：按照配方加入试剂并混匀（避免气泡）。将浓缩胶匀速倒入分离胶上方，避免气泡，插入梳子。等待30分钟，凝胶聚合后放入4℃保存，可加入少量电泳液或水保持湿润。二、上样与电泳内槽加入1x电泳缓冲液，确保液体浸没凝胶上端和胶板底部导电孔。外槽加满电泳液。样品与上样缓冲液按4:1比例混合，95℃-100℃加热5分钟。在同一片胶的孔中加入蛋白marker作为参照。电泳开始时使用80V低电压，待溴酚蓝跑过浓缩胶后，加大电压至120V。待marker显示的目标蛋白与其他蛋白明显分离时停止电泳。三、转膜根据胶的大小剪PVDF膜和滤纸，放入转膜缓冲液中平衡5分钟。组装转膜夹：红色朝下—海绵垫—滤纸—膜—胶—滤纸—海绵垫，夹紧后放入转移槽。加转膜缓冲液，将转移槽置于冰中。根据蛋白分子量确定转膜的电压、电流、时间。转膜结束后，切断电源，取出PVDF膜。四、封闭与免疫杂交将膜置于封闭缓冲液中，室温封闭2小时。加入稀释过的一抗，室温孵育1-2小时或4℃过夜。用TBST洗膜。加入稀释过的二抗，室温孵育1小时。 TBST洗膜。

WB实验中蛋白煮沸的四大原因在进行WB（Western Blot）实验时，每次上样前都需要将蛋白样品进行煮沸处理。这个步骤看似简单，但实际上却对实验结果有着至关重要的影响。那么，为什么每次上样都需要煮蛋白呢？让我们一起来探讨一下其中的原理吧！促进 SDS 与蛋白质的结合 𐟒ꊓDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，它能与蛋白质结合，使其完全变性和解聚，形成带负电荷的棒状结构。这种结构在电场中能够稳定迁移，是电泳分离的基础。然而，SDS 与蛋白质的结合并非自发进行，需要一定的条件来加速这个过程。高温处理（如煮沸）能够显著提高 SDS 与蛋白质的结合效率，确保蛋白质完全变性和解聚，便于后续蛋白质分子量大小的分离。破坏蛋白质的高级结构 𐟏—️ 蛋白质的高级结构（包括二级、三级和四级结构）是由多种非共价键（如氢键、疏水键、离子键等）维持的。这些高级结构在电泳过程中可能会干扰蛋白质的迁移，导致实验结果不准确。煮沸处理能够破坏这些非共价键，使蛋白质的高级结构解体，转变为线性结构。这样，蛋白质在电泳时的迁移率与分子量大小有关。灭活蛋白酶 𐟔动›‹白酶是一类能够水解蛋白质的酶类，它们的存在严重干扰 WB 实验结果。在样品制备和处理过程中，如果未能有效灭活蛋白酶，它们可能会降解蛋白质，导致实验结果出现偏差。煮沸处理是一种有效的灭活蛋白酶的方法，能够确保蛋白质在电泳过程中保持完整，不被降解。提高蛋白样品的稳定性 ⚖️ 煮沸处理不仅能够促进 SDS 与蛋白质的结合、破坏蛋白质的高级结构、灭活蛋白酶，还能够提高蛋白样品的稳定性。确保实验结果的可能性和重复性，每次上样前对蛋白样品进行煮沸处理，能够确保实验条件一致性，从而提高实验结果的可靠性和重复性。如果省略这一步骤，不同批次或不同实验者之间的实验结果可能出现较大差异。煮蛋白的具体操作步骤 𐟍𓊧…‹白的过程通常是将蛋白样品与上样缓冲液混合后，在沸水浴或PCR仪中加热至95-100Ⰳ，煮3-5分钟。加热过程中需要不断摇动或搅拌样品，以确保受热均匀。除个别蛋白样品外，如膜蛋白不宜高温，一般37℃放置10分钟，而核蛋白先配平后，不需要进行煮沸，直接离心上样。煮蛋白时间不宜过长，不然可能会导致蛋白变性，影响后续实验结果；煮蛋白温度控制在95-100Ⰳ之间为宜，常规煮蛋白时间为3-5分钟，如果样品浓度过浓时就煮10分钟。煮蛋白10分钟后，仍然吸不出来，适当增加 Buffer，继续煮，也可以对样品进行超声。若煮样的时间过长，蛋白出现凝固，建议丢了吧，没用了；煮蛋白过程中要记得混匀样本，确保样本受热均匀。通过以上几点，我们可以看出，煮蛋白在WB实验中扮演着至关重要的角色，确保了实验的准确性和可靠性。希望这篇文章能帮助你更好地理解WB实验中煮蛋白的必要性！

史上最全WB实验操作及原理讲解③ Western Blot 实验通常使用SDS-PAGE进行电泳，根据目的蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。以10%的SDS-PAGE自制胶为例，以下是详细的操作步骤和注意事项：制备凝胶 𐟧ꊨㅩ…好灌胶的模具，按照配方配置分离胶（适量的丙烯酰胺溶液、10% SDS、分离胶缓冲液），加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌（不要产生气泡）后缓慢加入到模具中。再在页面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40分钟。待凝胶聚合后，分离胶和水层出现一个清晰的界面，吸尽分离胶上的水。同样按比例配置浓缩胶（浓缩胶浓度较分离胶低），缓慢加入分离胶的上面，直至灌满。将梳子插入凝胶内，注意不得在梳子齿尖留有气泡，静置60分钟以上待凝胶聚合后拔出梳子。注意事项及原理 𐟓‹ 分离胶浓度：不同的分离胶浓度对不同的目的蛋白分子量的分辨率不一样，所以Western Blot中分离胶浓度的选择取决于目的蛋白分子量。过硫酸铵和TEMED的量：聚丙烯酰胺(PAGE)是由丙烯酰胺聚合形成的高分子，这个聚合反应是自由基聚合，需要有引发剂产生自由基将反应引发。过硫酸铵（AP）就是引发剂，而TEMED（四甲基乙二胺）可以催化过硫酸铵产生自由基，催化聚丙烯酰胺单体聚合成网状结构。但是两者的量一定适宜，否则会有烧胶或带变形的可能。加入一层水：在注入分离胶后上面需要加入一层水，这是因为空气中的氧分子会氧化AP使其活性减弱。加入这层水后可以让反应快速进行，同时也保证了分离胶上层面的平整。加样 𐟒犥𐏥🃦‹”出梳子，将制好的凝胶及玻璃板放入电泳槽内并组装好。将电泳缓冲液加入内外槽，使凝胶的上下两端均能浸泡在电泳缓冲液中。将待测蛋白样品与上样缓冲液按比例混合，沸水中加热3-5分钟使蛋白充分变性。将样品加入到凝胶孔中，同时必须在同一片胶的孔中加入蛋白marker作为参照。加样时间要尽量短，以免样品扩散。电泳 𐟔‹ 当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。电泳时通常上层浓缩胶时采用低电压（80-100V）恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层分离胶时采用高电压（120V）恒压电泳。溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端时停止电泳。电泳完毕的胶完整地放在盛有电泳液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来。持续更新，敬请关注~

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