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细胞铺板最新视觉报道_细胞铺板密度计算公式(2024年12月全程跟踪)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：热点更新日期：2024-11-30

细胞铺板

Fluo-4 AM实验，一次成功秘诀！今天来聊聊细胞流式技术中的一个重要实验——Fluo-4 AM的Protocol。这个实验我一次就成功了，来分享一下我的经验，希望对大家有帮助。 𐟔 实验步骤 𐟔 以6孔板为例（通道是：FITC）首先，取对数生长期的细胞进行消化和计数，调整细胞数量为1㗱06/ml，然后在6孔板中接种，每个组重复3个孔。接种时要反复多次混匀。 24小时后，可以进行相应的处理，比如转小干扰、质粒或药物处理等。按照说明书，弃去培养基，用PBS洗3遍，然后加入Fluo-4 AM（1:1000 PBS稀释），37℃孵箱孵育30分钟。孵育完成后，用PBS多洗几遍。注意不能用完全培养基孵育，因为血清中的酯酶会分解Fluo-4 AM，而酚红会导致荧光背景增强。用不含EDTA的胰酶消化4分钟左右（根据自己细胞的情况调整），800r，5分钟离心。孵育完后，用PBS洗1遍，800r，5分钟离心。用500ul PBS重悬后插冰上，1小时内上机。 𐟒ᠥ𐏨𔴥㫠𐟒ኧ𛆨ƒž状态要好：流式实验对细胞状态要求很高，状态不好的细胞不要进行实验，浪费试剂还浪费时间。细胞铺板要均匀：细胞铺板不均匀会导致转染失败，影响结果的真实性。选择不含EDTA的胰酶：尽量选择不含EDTA的胰酶，否则会影响消化效果。把握好消化时机：消化时间要掌握好，过度消化会影响细胞状态。吹打力度要适中：终止消化后，用PBS再次清洗重悬细胞时，吹打力气不宜过大。细胞量要足够：细胞数量太少，流式检测结果不准确。提前了解探针波长：提前了解探针的波长和流式图类型，避免上机时手忙脚乱。流式圈门很重要：避免将左下角的死细胞圈进去，影响结果判读。大家学会了吗？有任何问题欢迎在评论区留言哦𐟑‡𐟑‡

油红O染色，揭秘脂肪！油红O染色法是一种用于检测组织或细胞内脂肪含量的方法。油红O（Oil Red O）是一种脂溶性染料，具有很强的脂溶剂和染脂剂特性，能够在脂肪内高度溶解。其染色原理是油红O能与组织和细胞内的中性甘油三酯、脂质以及脂蛋白产生吸附作用，从而使脂肪染色。 𐟧ꠥꌦ�꤯𜚊 1️⃣ 细胞铺板：在12孔板中铺好细胞，用显微镜观察。 2️⃣ 固定细胞：弃去培养基，用PBS润洗，加入少量4%多聚甲醛固定细胞10分钟（覆盖底板即可）。 3️⃣ 配制油红染料：将4%油红与DDH2O按1:1比例混合，滤膜过滤，静置。 4️⃣ 润洗细胞：弃去液体，加入60%异丙醇润洗，使细胞间质分明，10秒左右即可。 5️⃣ 染色：加入已配好的油红，覆盖底板，染色10分钟。 6️⃣ 清洗：弃去油红，用60%异丙醇洗，每孔10秒，时间不宜过短或过长。 7️⃣ 漂洗：将板子放在水盆里漂洗。 𐟓Š DMSO定量：将水倒干，加入DMSO 200微升每孔，萃取30分钟，450nm吸光度读数。 𐟔젦˜𞥾œ观察：配苏木素染料：用DDH2O稀释3倍，每孔加200微升，染色10秒。大量水清洗，每孔加入100微升清水，避免细胞干掉。打开显微镜观察。 𐟓𗠨🙩‡Œ也可以用ImageJ来进行定量化。

细胞免疫共沉淀实验（Co-IP）全攻略细胞免疫共沉淀实验（Co-IP）是一种研究细胞内蛋白质相互作用的重要方法。其基本原理是，如果细胞内两种蛋白质（A和B）有直接或间接的相互作用，那么在温和的裂解条件下获得的蛋白样品中加入A蛋白的抗体，可以将A蛋白沉淀下来，与其直接或间接相互作用的B蛋白或C蛋白也会一起被沉淀下来。通过Western blot检测沉淀中是否存在B或C蛋白，可以确定B或C蛋白与A蛋白的相互作用。 𐟔 用途检测A、B蛋白在体内是否相互结合分离与A蛋白相互作用的蛋白复合物 𐟧ꠦ料与仪器【样品和试剂】 293T细胞（以该细胞做转染为例）转染质粒（Flag-A，HA-B） Flag抗体 2㗠loading buffer PBS Flag-beads 1㗠TBST 5㗠SDS loading buffer 蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂A和B RIPA裂解液【实验仪器】磁力架金属浴 RIPA裂解液旋转混合仪 WB实验相关设备 𐟓 实验步骤一、细胞的铺板与转染提前一晚将293T细胞铺板至6cm皿中，铺板量以达到相应的转染试剂要求为准；用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染2皿细胞：Flag空载+HA-B；Flag-A+HA-B；每质粒2微克。二、免疫沉淀转染24小时后，收获细胞，每皿加入500裂解液，收集细胞至1.5mL EP管中，在冰上超声破碎细胞；超声好后，4℃，12,000g，离心30分钟，取400上清液用于免疫沉淀，80上清用作总蛋白并加入等体积的2㗠loading buffer；将400上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中，加入0.3-0.5 Flag抗体，4℃孵育3-4小时； 4℃，2,000g，离心3分钟，去除未结合的液体，留下beads沉淀，用预冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次，每次5分钟；最后一次去除清洗液，往沉淀中加入602㗬oading buffer，和总蛋白一起在沸水中煮沸15分钟。三、Western Blot检测通过SDS-PAGE分离样品，利用全蛋白样品作为对照，检测Flag-A和HA-B蛋白是否发生结合。 ⚠️ 注意事项对于内源的Co-IP检测应该用10cm皿来培养目的细胞，并维持较好的生长状态；如果该实验用于新蛋白的鉴定，应注意抗体重链和轻链的影响；该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。

Lipo2K转染秘籍𐟔劣## 转染前的准备工作 𐟧ꊧ𛆨ƒž铺板密度：这个可是关键！根据Lipofectamine 2000（Lipo2K）的说明书，不同孔板的铺板密度有不同的建议。我用的是12孔板，铺板密度是2㗱05cells/孔。大概培养20小时后，细胞密度可以达到60-70%。转染前一定要检查细胞的生长状态，浓度最好在60-70%之间。太稀的话，转染后细胞会死亡（虽然我有一篇笔记里转化效率高，但因为细胞密度低，结果部分细胞死了）；太浓的话，转染试剂无法有效输送到每个细胞中。铺板的均匀度：这个对我来说是个难题。底部细胞密集而四周稀疏会影响转染效果。我最近发现一个有效的方法，就是把稀释好的细胞悬液充分混匀，加入孔板后不要晃动，静置5-10分钟。这样铺出来的板子特别均匀！不过我只在24孔板和12孔板这样试过，96孔板可能还是需要敲打一下。培养时间：铺完板子后大约16-24小时就可以做转染了，注意观察细胞状态。培养基是否含抗生素：说明书建议使用不含抗生素的培养基铺板，但对于293T细胞来说，含抗生素的培养基也可以使用。质粒DNA转染 𐟌€ 准备质粒：这个过程一定要保证卫生！质粒的量：根据说明书给出的建议质粒用量和Lipo2K用量，实际用量可以根据需求调整。制备复合物（以12孔为例）：使用50 不含血清的Opti-MEM I培养基（或其他不含血清的培养基）稀释1ug DNA。轻轻混匀。使用前轻轻混匀Lipo2K，然后取4在50  Opti-MEM I培养基中稀释。混合（1）和（2）（总体积=100）。轻轻混匀并在室温下孵育15-20分钟（溶液可能变得浑浊）。注意：Lipo2K加入后会开始产生纳米球，应尽快将稀释好的Lipo2K加入混匀的质粒中。将100 复合物轻轻添加至含有待转染细胞的孔中。通过轻柔的摇动平板轻轻混匀。培养基可在4-6小时后更换（换液有助于减少Lipo2K转染导致的细胞毒性，对于293T细胞，不换也可以）。将培养板放回细胞培养箱即可。18-48小时可见GFP表达。希望这些步骤能帮到你，祝你实验顺利！𐟚€

细胞划痕实验：从原理到步骤的详细指南 𐟔슧𛆨ƒž划痕实验是一种常用的方法，用于研究细胞迁移和修复能力。它的基本原理是在体外培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其他硬物划出一条线，去除中央部分的细胞，然后继续培养至设定的时间，观察并记录细胞的生长和迁移情况。通过不同分组之间的细胞修复能力的差异，可以判断各组细胞的迁移与修复能力的差别。 𐟔 实验步骤：准备工具：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和 marker 笔在操作前要在紫外下照射 30 分钟。培养板划线：先用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔 0.5~1 cm 一道，横穿过孔，每孔至少穿过 5 条线。细胞铺板：在孔中加入约 5㗱05 个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。细胞划线：第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。洗细胞：划痕完成后，使用无菌 PBS 洗细胞 3 次，洗去不贴壁的细胞，然后更换新鲜无血清培养基。细胞培养及观察：放入 37℃、5% CO2 培养箱，培养；按 0，6，12，24 小时取样，倒置显微镜观察特定位置细胞迁移情况并拍照。结果分析：使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6-8 条水平线，计算细胞间距离的均值。 𐟒ᠥꌥ𘸨灩—˜：适用范围：划痕法测量适用的细胞范围较小，一般只适用于上皮细胞和纤维样细胞。无血清培养：虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。冲洗时注意事项：在用 PBS 缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。低血清培养：一般做划痕实验，需要排除细胞增殖的影响，一般在不影响细胞增殖的情况下采用低血清（<2%）或者无血清。否则细胞增殖就不能忽略，这样对于迁移较慢的细胞就需要延长拍摄时间（也可用丝裂酶处理一小时）。固定检测点：按照 6 孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。培养基更换：每次拍照前、后，尽量换掉培养基，去除飘落的细胞，能得到较为干净的划痕区域。通过这些步骤和注意事项，你可以更好地理解和掌握细胞划痕实验的原理和方法。

内参不齐 Western Blot实验中，调整内参是关键的一步。以下是一些实用的技巧，帮助你快速且稳定地调整内参：选择合适的内参：可以查阅文献、遵循师门传统或通过通跑测试来选择合适的内参，例如GAPDH、Tublin或beta-actin等。 BCA法测定组织蛋白浓度：虽然有时候测完也不齐，但在测完的基础上调整更为方便。细胞铺板均匀：细胞不需要测BCA，但需要保证铺的板细胞均匀，这样上样量才能更准确。统一浓度上样：先统一浓度上样，再根据发光结果进行相应调整。浓的少加，淡的多加，这主要靠经验。确保电泳、转膜、封闭无误：在调整上样量之前，必须保证电泳、转膜和封闭没有问题，这样调整才能更准确。通过这些步骤，你可以更有效地调整内参，使Western Blot实验更加准确和可靠。

𐟔젥𙳦🥅‹隆形成实验全攻略：步骤与技巧 𐟓 实验步骤（以6孔板为例） 1️⃣ 制备细胞悬液：将处于对数生长期的单层细胞进行常规消化离心，收集细胞沉淀。重悬细胞沉淀并计数，可倍比稀释至1㗱0ⳤ𘪯mL。 2️⃣ 接种细胞：以每孔50、100、200个细胞的梯度密度接种六孔板中（根据细胞生长情况确定），补加3mL培液，置于培养箱中培养，静置2-3周。若需加药处理，可于第二天贴壁后加药。 - 注意事项：计数要准确，最好计3遍取平均值；接种细胞时要晃匀；培养过程中注意培液颜色，必要时更换培液并观察污染情况。 3️⃣ 染色：当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，停止培养，弃掉培液，用PBS小心洗涤2-3次，弃掉PBS。每孔加入1ml甲醇固定15min，弃固定液。每孔加入1ml 0.1%结晶紫或Giemsa染色液染色10-30min，流水缓缓洗去染液，空气干燥。 - 注意事项：培养过程中可隔两三天在显微镜下观察，若大多数克隆含50个以上细胞，即可终止培养。 4️⃣ 计数：镜下计数含50个细胞以上的克隆数并拍照，取3个复孔的克隆平均值进行计算。实验至少重复2次。 𐟔 常见问题解答细胞密度为多少合适？细胞接种密度与实验结果密切相关。若细胞太多，形成克隆数目太多，难以拍到单独的克隆团；若细胞太少，可能无法形成克隆，影响增殖能力判断。一般来说，正常增殖速度为1:5-1:10传代，3天长满细胞，可以接种500个细胞，其余增殖缓慢细胞，可以接种800-1000。细胞接种后培养的时间如何确定？通常情况下，单个细胞在体外增殖6代以上所组成的细胞群称为一个阳性克隆，时间约为一周；但具体时间因细胞增殖能力而异，因此应密切关注细胞生长情况，隔天在显微镜下观察克隆情况，若单个克隆细胞数到达50个左右即可固定细胞。细胞铺板均匀的重要性若铺板不均匀，细胞稀的地方形成的克隆少，而密的地方克隆多，一方面影响统计结果，并且拍出的图片不美观。细胞未形成克隆的原因？并非每种细胞都可以形成克隆，克隆形成率与细胞本身增殖能力有关。还与接种细胞密度、加入培养液的体积、血清浓度有关。因该实验处理时间较长，应给细胞多加培养基，如每孔4ml，或者3天更换一次培养基，以供给细胞充足的营养。

细胞计数全攻略：从原理到实践细胞计数是生物学实验中一项基础但至关重要的技术。它不仅用于计算细胞数量，还能帮助我们了解细胞的存活率和生长状态。以下是详细的实验步骤和注意事项，供大家参考。 𐟔 实验原理细胞计数的核心是通过计算一定体积细胞悬液中的细胞数目，来换算出每毫升细胞悬液中的细胞数量。我们通常使用血球计数板来进行计数，该计数板由四个大正方形组成，每个大正方形包含16个小格，每个小格的体积为0.0001毫升。 𐟓 实验步骤准备计数板：用酒精喷洒计数板，然后用吸水纸擦干备用。取样：将充分混匀的细胞悬液取10微升，加入计数板的上样口，确保细胞悬液铺满整个网格，不溢出、不过少且无气泡。如果需要进行细胞存活率测试，可以加入适量的Trypan blue进行染色，但计算时要乘以相应的稀释倍数。镜下计数：在显微镜下计数四个大方格中的细胞数。注意，2个以上细胞组成的细胞团按一个细胞计算，压线的细胞记上不记下，记左不计右，以避免重复计数。计算：将四个大方格中的细胞数相加，乘以稀释倍数，再乘以104，然后除以4，即可得到每毫升细胞悬液中的细胞数量。铺板计算：假设需要铺40孔，每孔100微升，每个孔细胞数为3000个。如果四个正方形的细胞计数分别为55、60、51、49，则每毫升细胞悬液中的细胞数为（55+60+51+49）/4㗱04=54㗱04。目标细胞数为3000㗴0=12㗱04个，总体积为100㗴0=4毫升。因此，需要取0.222毫升细胞悬液，并加入3.778毫升培养基，每孔再加入0.1毫升。 𐟓 注意事项计数板和盖玻片使用前后均应用酒精喷洒后吸水纸擦干。取样前应充分混匀细胞悬液，以减少误差。镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团占10%以上，说明消化不充分；或细胞数少于200个/10毫米Ⲧˆ–多于500个/10毫米Ⲧ—𖯼Œ说明稀释不当，需重新制备细胞悬液并进行计数。 𐟎‰ 实验结论通过以上步骤，我们可以准确地计算细胞悬液中的细胞数量，了解细胞的存活率和生长状态。希望这些信息对大家的实验有所帮助，祝大家实验顺利！

科研必备：细胞铺板实验的五大技巧细胞铺板实验是科研工作中必不可少的一环，掌握正确的操作方法至关重要。以下是几个关键步骤，帮助你更好地进行细胞铺板实验： 6孔板、12孔板、24孔板铺板技巧 𐟧ꊩ斥…ˆ，为了防止表面张力导致的中间液面过低而细胞聚集的现象，每孔应先滴加少量培养基或PBS，轻轻晃动以浸润整个孔底。这样，加入细胞悬液后，细胞会均匀地铺在整个孔底，避免中间位置和周边细胞分布不均的现象。加完细胞悬液后，将板子放在工作台上静置5-10分钟，然后镜下观察细胞的均匀度。如果发现不均匀，可以采用十字法等方法进行调整。 96孔板铺板技巧 𐟧ꊥ﹤𚎹6孔板，每孔通常加入100细胞悬液。加样时，倾斜枪头，从孔的左边靠近底部缓慢加入（过快容易导致细胞聚集）。建议每加完半块板子时，将细胞重新混匀，继续加样。加样结束后，镜下观察如有局部不均匀现象，可以采取敲击法：将板子置于台面上，左手持住板子的左边，右手轻轻敲击板子的右边缘5-8次。注意力度不要过大或次数过多，否则反而容易导致细胞聚集。然后将板子顺时针旋转，依次敲击剩余三个边（据说逆时针效果不好），静置5-10分钟后，放入37℃培养箱。小贴士 𐟒ኦ— 论使用哪种孔板的铺板方法，都要确保细胞悬液均匀分布在整个孔底。这样不仅有利于细胞的生长，还能提高实验的准确性。同时，注意操作过程中的细节和技巧，可以大大提高实验的成功率。通过以上步骤，你就能更好地掌握细胞铺板实验的关键技巧，为科研工作打下坚实的基础。

新途径揭秘！体外研究吞噬 𐟌 想要深入了解吞噬作用如何受到吞噬目标表面特定变化的影响吗？这里介绍一种创新的体外技术，它基于可添加已知分子的脂质膜包被的靶颗粒，让你能够随意改变相互作用的分子。 𐟔젩𖩢—粒的制备首先，我们需要在玻璃微球（glass beads）表面包裹一层脂质双分子层，然后偶联蛋白或其他感兴趣的配体。脂质双分子层的组成可以改变，以结合和定向特定的蛋白质，结合信号和报告脂质，并控制脂质双分子层的流动性。 𐟒‰ 重组靶颗粒的吞噬实验流程巨噬细胞铺板：将巨噬细胞计数后铺在96孔板，来源可以是多样的。需要37Ⰳ、5% CO2孵育一段时间使得细胞粘附在板底。清洗glass beads：任何beads在使用前都需要充分混匀。清洗分为两步：用浓硫酸和过氧化氢超声清洁beads表面的有机物，再用纯水离心去除残留溶剂。最后使用纯水重悬beads。形成小的单层脂质囊泡：确定所需的脂质种类，包含荧光素或生物素标记，据浓度和所需的摩尔分数计算所需的脂质体积。经历干燥、水合、超声，将脂质制备成小的单层脂质囊泡（双分子层），使用0.2 ⵭滤器过滤掉大的聚合物。4℃保存并且在2 d内使用。制备靶颗粒：混匀MOPS buffer、脂质囊泡和干净的beads，旋转孵育。注意不同的脂质组分的孵育温度和时间不一样。室温低速离心，温和沉淀beads，弃上清。再加PBS重悬混匀。蛋白或抗体加入到beads中。蛋白的最佳浓度为50 nM，抗体的最佳浓度为0.125 ⵧ/mL。室温旋转孵育。重组靶颗粒的吞噬：将靶颗粒轻轻滴入预先接种巨噬细胞的96孔板中，37Ⰳ、5% CO2孵育。PBS清洗。加入细胞染料（10ⵧ/ml Hoechst Nuclear dye和0.5 pM CellTracker Green CMFDA in PBS）孵育，使染料在成像前进入细胞。图像获取：调整荧光显微镜参数，获得细胞核（Hoechst）、胞质（CMFDA）和beads（647-DOPE）三个通道的荧光图像。确保每孔捕获足够的视野，总细胞数≥500。该过程可通过自动进行多孔板成像的显微镜软件实现自动化。 𐟔젩€š过这种技术，你可以深入研究吞噬作用如何受到吞噬目标表面特定变化的影响，从而更好地理解细胞生物学的基本原理。

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