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emsa实验原理新上映_emsa实验结果分析(2024年12月抢先看)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：导读更新日期：2024-11-30

emsa实验原理

DAP-seq常见问题解答，一文搞定！ 1. 𐟔 DAP-seq技术原理与流程技术原理：DAP-seq通过体外表达蛋白与DNA进行亲和纯化，洗脱后进行高通量测序，从而找到转录因子的结合位点。技术流程：构建含有亲和标签的载体，体外表达转录因子与亲和标签的融合蛋白，提取基因组DNA并构建DNA文库。将体外表达的转录因子与DNA文库结合，洗脱后上机测序。解决的问题：快速定位转录因子的结合位点，发现转录因子调控的靶基因。 𐟓š 所需材料组织材料或提取好的基因组DNA 目标蛋白质粒（含有完整目标蛋白序列的质粒，如转录因子） 𐟓ˆ 实验成功率不同转录因子家族的成功率有所不同，具体成功率可参考相关资料。 𐟔„ 重复次数实验包含两个技术重复，以确保结果的可靠性。 𐟌𑠦䍧‰駻„织样本要求植物组织样本的取样时期和部位根据研究需求确定，不同组织和时期DNA的修饰可能影响蛋白与DNA的结合。 𐟔전AP-seq与ChIP-seq的区别 DAP-seq不需要针对每个转录因子制备特异性抗体，具有快速、高通量和节约时间成本的优势。 𐟓Š Input对照 Input对照用于降低背景噪音，是亲和纯化前的文库。 𐟓Œ Peak数目少的结果可用吗？虽然DAP-seq的peak数目较少，但建议仍然对现有结果进行分析，可能挖掘出亮点结果。 𐟔젩ꌨAP-seq结果 DAP-seq结果一般需要验证，验证手段包括EMSA、酵母单杂等实验。如果通过前期大量转录因子筛选出候选转录因子，也可以考虑体内ChIP等验证。

WB实验必备试剂大揭秘𐟔 在WB实验中，各种试剂扮演着至关重要的角色。你是否也对这些试剂的作用感到困惑？今天我们就来详细解析一下这些试剂的功能𐟑‡𐟑‡𐟑‡ 1⃣ SDS SDS，即十二烷基硫酸钠，是一种表面活性剂、洗涤剂和乳化剂。蛋白质的三维结构复杂且带有不同电荷，这会影响其在凝胶中的电泳迁移速率。SDS的作用是使蛋白样本变性，结合在蛋白表面并使其带上负电荷，从而只根据分子量大小产生不同的迁移速度，最终使大小不同的蛋白分开。 2⃣ 巯基乙醇 巯基乙醇是一种还原剂，外观为无色的透明液体，闻起来有强烈的刺激性气味，且对人体有刺激性。在WB实验中，它可以打开蛋白里半胱氨酸残基之间的二硫键，切割二硫键可以破坏蛋白的二级结构，使得蛋白样本在电泳过程不受二级结构的影响。 3⃣ 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是一种聚合物，由丙烯酰胺单体和交联剂组成。通过改变单体和交联剂的比例以及聚合条件，可以调节聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小和分辨率范围。浓度越高，形成的孔径越小，更易于分辨小分子。在Western blot实验中，不同分子量的蛋白质在凝胶中迁移速率不同，分子量较小的蛋白质迁移速率快，而分子量较大的蛋白质迁移速率慢，因此可以通过电泳分开不同大小的蛋白。 4⃣ 吐温20 吐温20是一种非离子型去垢剂，通常是黄色或琥珀色澄明的油状液体，非常粘稠。在WB实验中，通常会在封闭液或抗体洗涤液中加入吐温20，起到封闭的非特异性的作用。 5⃣ TEMED TEMED中文名称是四甲基乙二胺，是一种促凝剂。在配置SDS聚丙烯酰胺凝胶时，与过硫酸铵 (APS)一起使用，促进凝胶凝固。但是TEMED有神经毒性，应该在通风橱操作。 6⃣ Tris HCl Tris HCl是一种常见的缓冲液，在WB实验中，电泳液及制胶都需要用到Tris HCl，主要作用是维持稳定的pH值。通过了解这些试剂的作用，你可以更好地理解和掌握WB实验的原理和技巧。

EMSA实验：GST/His-a融合蛋白的表达 GST/His-a融合蛋白的表达 (1)将目的蛋白与GST/His的重组质粒转化到BL21菌株中； (2)挑取单克隆到含有5 ml LB培养基（加入5 氨苄）的10 ml试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜； (3)将培养菌液转移到含有500 ml LB（含500 氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200 rpm培养数小时； (4)测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，200rpm条件下培养10-16 h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）； (5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50 ml离心管中，4℃ 4000 rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中； (6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10 min后弃去上清，再按每10 ml菌液沉淀1 ml PBS的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中； (7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。每次超声破碎20 s，间隔30 s（破碎时间、破碎次数和间隔时间视具体情况而定），经过适当时间超声后，溶液会显得澄清； (8)将超声后的溶液4℃ 4000 rpm离心10分钟，上清液转移至新的离心管中，-80℃保存备用。凝胶迁移（ EMSA ）实验技术方法步骤已分享，如有相关科研问题，欢迎留言探讨。 #研究生日常#⠂ #EMSA#⠂ #凝胶迁移实验#⠂ #蛋白表达#⠂ #实验外包#

EMSA实验揭秘：凝胶迁移 𐟌 凝胶电泳：在开始EMSA实验之前，首先需要制备6.5%的凝胶。与常规的凝胶电泳不同，EMSA实验无需分离胶和浓缩胶。在加入10%的过硫酸铵（AP）之前，确保凝胶在室温下静置10分钟以去除气泡。然后，加入10%的AP并混匀，灌胶。 𐟔砩℧”𕦳𓯼š 在加样电泳之前，进行预电泳以去除残余的杂质。使用预冷的0.5㗔BE缓冲液，以100V恒压电泳30-60分钟。预电泳过程中，用移液器反复冲洗上样孔3-5次。 𐟧ꠥˆ𖦠𗯼š 根据表格中的mix配方，配置反应体系。由于样品数量较多，建议使用mix混合液以减少加样误差并节省操作时间。将配置好的反应体系分装到标记好的PCR管中，依次加入双蒸水、核蛋白和生物素标记的探针，室温孵育10分钟。 𐟚€ 上样：孵育结束后，加入5的Loading Buffer，轻轻吹打混匀，准备上样。在电泳结束前，配置好0.5㗔BE电转移缓冲液并放置于冰箱预冷。将样品加载到样品孔中，以100V恒压低温条件下电泳45分钟，至指示剂到达胶的2/3处。 𐟌 转膜：电泳结束后，小心地从电泳装置中移走一片玻璃片，去掉样品孔的凝胶。将凝胶与另一片玻璃一起移入装有0.5㗔BE的盒子中，让凝胶与玻璃板分离并漂浮在缓冲液中。 𐟔砦𕸦𓡤𘎨𝬥𐯼š 将尼龙膜、同胶一样大小的厚滤纸及海绵垫在0.5㗔BE中浸泡10分钟。在转印夹的黑色面板中心依次放置海绵垫、至少3层印迹滤纸、转印膜、胶和至少3层滤纸。用玻璃试管在滤纸上轻轻滚动，以驱赶气泡。 𐟔頤𚤨”：将装配好的电转移夹放入电转移槽中，在0.5㗔BE中以100V恒压转45分钟。转膜结束后，将膜放置于干净滤纸上，膜正面朝上，放置在紫外灯下10厘米处，交联20分钟，交联前保持膜湿润。

EMSA实验数据分析与注意事项全解析在进行EMSA实验时，数据分析是关键的一步。通常，我们可以从两个方面来分析数据：底部的自由探针和上方的迁移条带（蛋白-DNA复合物）。当蛋白与DNA发生相互作用时，底部的自由探针会减少，而迁移条带的亮度则会增强。 𐟓Š 数据分析在加入等量标记探针的前提下，如果增加未标记的野生型探针，它会与标记探针竞争蛋白，导致自由探针条带强度基本不变，而迁移条带亮度减弱。相反，如果增加未标记的突变探针，由于蛋白不结合该序列，突变探针不与标记探针竞争，因此自由探针减少，迁移条带亮度增强。 𐟔 注意事项探针长度：合成的探针长度在40–60bp左右，这样有利于非结合探针和蛋白-DNA复合体的分离。探针保存：标记好的探针若不立即使用，可以保存于–30 Ⰳ冰箱中，再次使用时于冰上融化即可。实验条件优化：由于不同转录因子与DNA之间结合的强度不同，在试验中要对重组蛋白用量、探针浓度以及缓冲液配方等因素进行摸索，以确定最佳实验体系。尼龙膜处理：紫外交联后的尼龙膜可在室温条件下放置数天，注意在封闭之前勿再次吸湿。器具清洁：在操作过程中确保所用器具洁净，避免SDS或其它杂质污染。通过以上步骤，你可以更准确地分析EMSA实验数据，从而得出更可靠的结论。

如何快速发表文章？研究生必看！ ✅ 一入研究生的大门，就赶紧去实验室吧！早点上手，培养细胞、提取质粒、跑电泳、做Western，练好基本功，了解导师的研究方向，选择你感兴趣的小方向。就像“熟读唐诗300首，不会做诗也会吟”，趁着有空，赶紧看文献吧。 ✅ 实验平台非常重要，重要的事情说三遍！好的实验平台是什么？有水平的导师和良好的科研氛围，有好的动物实验室，有大量的基础实验工具，有先进的实验方法以及一脉相传的实验经验，当然齐全的仪器设备也不能少。好的实验室能帮你节省大量时间，让你有更多时间去创新。在你实验遇到问题时，有水平的导师能及时帮你找到失败原因。比如你想验证NFKB的活性，实验室有NFKB相关质粒，师兄师姐有做EMSA的经验，实验分分钟搞定，结果还特漂亮。若没有，你得写邮件求质粒或自己构建，费时费力。那么你选对平台了吗？ ✅ 开始实验时不要把鸡蛋放在一个篮筐里，研究两个小方向，两手都要硬，根据研究进展再调整侧重。 ✅ 奋斗！奋斗！奋斗！要想尽快出文章，8小时工作制就是奢侈品！ ✅ 青年研究学者（有基金，但有大量教学、医疗工作）没时间、没学生怎么办？生物公司现在如雨后春笋，既然当小Boss了，有些东西就花钱吧，如包装病毒，雇人做些基础实验，外包实验（不过要找个靠谱的，现在审计严格着呢！）。

EMSA实验探针设计八大原则，你知道吗？ EMSA实验中，探针设计至关重要，以下是探针设计的八大原则：序列选择 𐟧슩€‰择包含目标结合位点的DNA或RNA序列作为探针，这是实验成功的关键。结合位点 𐟔— 确定目标蛋白质的结合位点核心序列，有助于准确识别和定量结合反应。互补性 𐟤 探针序列应与目标结合位点互补，形成稳定的双链结构，确保实验准确性。标记方式 𐟌Ÿ 常见的标记方式包括放射性同位素标记、荧光标记、生物素标记等，选择适合的标记方式可以提高实验灵敏度。长度和纯度 𐟓 探针长度不宜过长，以免增加结合复杂性；同时，确保探针的纯度，避免杂质干扰结合反应。负对照 𐟚늨𘀤𘪤𘎧›‡结合位点不相似的负对照探针，验证特异性结合，确保实验结果的特异性。敏感性和稳定性 𐟔犩€š过优化探针浓度、反应条件和电泳条件，确保实验结果的准确性和可重复性。遵循这些原则，你的EMSA实验将更加精确和可靠！

互作机制研究方案 CoIP-Mass⠠⠠⠠⠠（ IgG-IP vs Ab-IP ） CoIP-WB⠠⠠⠠⠠⠠⠯𜈠1个候选蛋白检测） Pulldown-Mass⠠⠯𜈠对照和目的蛋白） Pulldown-WB⠠⠠⠯𜈠1个候选蛋白检测） HuProt蛋白组芯片检测⠠⠠⠯𜈠20K+蛋白互作检测） RIP-seq⠠⠠⠠⠯𜈠Input vs Ab-IP ） RIP-qPCR⠠⠯𜈠1个候选RNA检测） ChIP-Seq⠠⠠⠯𜈠Input vs Ab-IP ） ChIP-qPCR⠠（ 1个候选DNA检测） EMSA⠠⠠⠠⠠⠠⠯𜈠蛋白和DNA检测） ChIRP-Mass （ Target vs LacZ Probe ） ChIRP-Seq⠠⠯𜈠Target vs LacZ Probe ）以上如有相关问题，欢迎来询。 #科研#⠣实验外包#⠣研究生#

EMSA凝胶迁移实验全攻略𐟓–✨ 𐟌ˆ 探索EMSA凝胶迁移实验的奥秘，这里有一份详尽的实验笔记等你来发掘！ 𐟒報. GST/His-a融合蛋白的纯化步骤：在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的磁珠，4℃摇床上缓慢摇动30~60 min。 4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，磁珠上结合了GST/His-a融合蛋白。加入500 预冷的PBS溶液，轻晃悬浮珠子，4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，重复此步骤3次。最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST/His-a的磁珠。 𐟔젲. 探针的标记：使用生物素标记EMSA探针。 𐟓Š 3. EMSA结合反应：根据实验需求进行EMSA结合反应。 𐟔破. EMSA胶的配制以及电泳：制备4-6%非变性聚丙烯酰胺凝胶。加样前先在0.5X TBE buffer中80V预电泳10 min，预电泳完毕后冲洗加样孔。混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。恒压80V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3 cm为止（大约50-60 min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长，温度不能超过30℃）。 𐟌 5. 转膜：在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，尼龙膜（至少提前10 min 侵泡），滤纸和纤维垫。按顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒流250mA转膜1h（注意根据实际情况调整电流及时间）。转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干燥。 𐟌Ÿ 6. 交联：紫外交联：转完后的膜，放入方皿中，在紫外灯下交联3-10 min（具体时间根据实际调整）。 𐟒ᠷ. 化学发光法检测生物素标记的探针：室温封闭15 min。加入适量的Streptavidin-HRP Conjugate，室温孵育15 min。洗涤3次，每次5 min。按1：1的比例将ECL发光液均匀滴到膜上。曝光，显影，定影。 𐟔 下回我们将分享EMSA实验结果分析，敬请期待！

𐟧쎆-KB p65活性检测大揭秘𐟔 𐟔즠𘨽쥽•因子NF-kappaB（NF-kB）可是个大家伙，它参与调控炎症、抗凋亡、肿瘤形成等好多重要过程呢！其中，p65(RelA)这个亚基可是个关键角色。 𐟒᤽ 知道吗？p65和其他几个亚基，比如p50、p49（也被称为p52）、p75（c-Rel）和p68（RelB），一起构成了NF-kB的大家庭。它们有的起反式激活作用，有的则具有DNA结合活力。 𐟔检测NF-KB p65的活性，其实就是要看看这个亚基是否在细胞核中活跃地与DNA结合。我们可以通过一系列复杂的实验，比如凝胶迁移实验，来观察这一过程。 𐟒‰在凝胶迁移实验中，我们会用到纯化的蛋白或者细胞核抽提物，然后在特定的条件下，让NF-kB与DNA结合。如果p65活性高，那么就会形成特定的凝胶迁移复合物，我们就可以通过电泳和染色来检测到它。 𐟓Š最后，我们还可以利用不同形式的NF-KB p65抗体，来捕获细胞核蛋白并加以区分。通过酶标仪450nm处的吸光度值测定，我们可以定量比较目的蛋白的活化度，从而得出一个明确的结论。 𐟎‰这样，我们就可以轻松地检测出NF-KB p65的活性啦！是不是感觉很有趣呢？快来试试吧！