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二代测序原理权威发布_二代测序原理及步骤(2024年12月精准访谈)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：观点更新日期：2024-11-30

二代测序原理

引物纯化哪家强？比拼揭晓！引物纯化是分子生物学实验中至关重要的一步，它关系到后续实验的成败。以下是几种常见的引物纯化方法，它们各有千秋，适用于不同的实验需求。 𐟌Ÿ HAP纯化（高亲和性纯化） HAP纯化基于DMT（二甲基三苯甲基）基团对HAP树脂的特异性吸附。在纯化过程中，含有DMT基团的目的DNA能够特异性地吸附到HAP树脂上，而短链DNA则不会被吸附。这种方法能够显著提高引物的纯度，甚至可以达到98%以上，与PAGE、HPLC等传统纯化方法相媲美。 ✅ 特点高纯度：HAP纯化方法能够显著提高引物的纯度，有报道称其纯度可达到80%~90%，甚至在某些情况下可以达到98%以上，与PAGE、HPLC等传统纯化方法相媲美。快速高效：相比其他纯化方法，HAP纯化过程更加快速。例如，用HAP方法纯化的引物一轮只需2小时，可以显著缩短交货时间，提高实验效率。成本效益：HAP纯化方法不仅速度快，而且成本相对较低。这使得它在科研和生产中具有更高的经济效益，有助于节约科研经费和时间。适用范围广：HAP纯化方法适用于多种分子生物学实验，包括DNA测序、基因合成、PCR反应、点突变、分子杂交和基因芯片技术等。特别是对于长度在10-39mer以下的合成oligo DNA制品，HAP纯化方法能够提供高质量的纯化效果。 𐟒砨„𑧛纯化（DSL，C18柱脱盐）脱盐纯化又称为简易反相柱纯化，其原理是利用柱子对DNA的特异性吸附，这种吸附可以被有机溶液洗脱，但不会被水洗脱。因此，该方法能有效地去除引物中的盐分，但并不能有效去除比目的片段短的小片段。 ✅ 特点速度快、成本低：这种方法速度快、成本低，适用于大多数常规分子生物学实验，但对于需要高纯度的应用（如测序、克隆）则不适用。 𐟔„ OPC纯化 OPC（Oligonucleotide Purification Cartridge）纯化是基于DNA保护基（DMTr基）和纯化柱中树脂间的亲合力作用。在合成过程中，DNA片段的5'-端会保留一个DMTr基团，这个基团可以与纯化柱中的树脂特异性结合。通过一系列洗脱步骤，可以去除未结合的杂质和短片段，从而得到高纯度的目的DNA。 ✅ 特点适用于短引物：OPC纯化适用于长度在40mer以下的引物，纯度通常大于95%。这种方法适用于多种实验需求，包括PCR、测序和探针制备等。以上几种纯化方法各有千秋，选择合适的方法可以提高实验效率和质量。希望这些信息对您有所帮助！

高中生大学生必看！12周生物科研全攻略生物科学是理科学科中的重要领域，对于想要申请留学或保研的学生来说，一段高质量的科研背景至关重要。今天，我将介绍一个令人难以抗拒的生物技术科研项目。 𐟎“适合年级：高中生/大学生 𐟔쩀‚合专业：生物化学、生物医学、分子与生物医学、应用化学、分析化学、仪器分析、光谱学等专业，或希望修读相关专业的学生 𐟓‹项目大纲：仪器分析与生物传感器概论紫外可见吸收光（UV-Vis）分析法荧光探针传感器（Fluorescent probes）：荧光探针及传感器在生物医学领域的应用非标记检测技术（Label Free Detection）：作为基因组测序工具及医学诊断和筛查酶联免疫抗原检测法（ELISA）原理及其在病毒检测、DNA测序方面的应用微流控传感器分析项目回顾与成果展示论文辅导 𐟔쩡𙧛‹绍：这个项目将介绍现代分析化学中的仪器分析，重点包括微流控传感分析、紫外吸收可见光谱、荧光探针传感器等，涵盖化合物及分子的定量精密检测技术。学生将通过项目了解多种现代分析仪器的类型和运作机制，掌握仪器分析的原理、方法和应用领域。项目结束后，学生需提交项目报告并进行成果展示。 𐟎项目收获： 7周在线小组科研学习+5周不限时论文指导学习，共125课时项目报告主导师推荐信 EI/CPCI/Scopus/ProQuest/Crossref/EBSCO或同等级别索引国际会议全文投递与发表指导（可用于申请）结业证书成绩单无论你是高中生还是大学生，这个生物技术科研项目都将为你提供宝贵的科研经验和学术背景，为未来的学术研究和职业发展打下坚实的基础。

单细胞测序：谁更强？单细胞测序是一种基于二代测序（NGS）的方法，用于检测群体中单细胞的基因组、转录组、表观基因组和蛋白组，从而提供高分辨率的细胞间差异视图。其中，单细胞转录组测序（Single-cell RNA-Sequencing，ScRNA-Seq）最为常见。 Smart-seq和10x Genomics是两种重要的单细胞测序技术。Smart-seq采用全转录组扩增方法，利用oligo-dT引物和模板置换技术扩增cDNA全长。而10x Genomics则只能获得3'端转录本信息，非全长扩增。 C1 /Smart平台（Fluidigm）是最早应用于单细胞领域的商业化分选技术之一，于2013年推出。该平台通过微流体（FACS）实现96个细胞的自动分离、cDNA合成和基于Smart-seq的扩增。而Chromium（10x Genomics）平台以及其他平台如ddSEQ（Bio-Rad/Illumina）、Nadia（Dolomite）和inDrop（1CellBio）则基于微流控系统（Droplet），将单细胞技术的通量提高到了10000-100000个细胞的量级。 10x Genomics和Drop-seq的测序原理相似，都是通过将细胞封装在微小液滴中进行平行分析来分析数千个单个细胞中的mRNA表达。Drop-seq的具体步骤包括：从组织中制备单细胞悬液将每个细胞与一个带有barcoded微粒（bead）共封装在纳升级液滴中在液滴中分离细胞并裂解捕获细胞的mRNA在伴随微粒上形成STAMP（附着在微粒上的单细胞转录组）在一次反应中反向转录、扩增和测序数千个STAMP 使用STAMP条形码推断每个转录本的来源细胞 Barcode的合成方法是将细胞分为四群，分别标记A、G、C、T四个不同碱基。然后汇合所有细胞重新分为不同的四群，标记AGCT。重复上述步骤12轮，理论上可标记16777216个细胞。

𐟧줺Œ代测序技术全解析𐟔 𐟔쥻𚥺“原理大揭秘𐟔 1️⃣ DNA打断：为了适应Illumina测序的长度限制，通常将DNA打断至150-350bp。这一步通过特定方法进行，确保片段大小均匀。 2️⃣ 补平与加A：打断后的DNA末端可能不平整，需用酶补平，并加上一个特异的碱基A，为后续接adapter做准备。 3️⃣ 连接adapter：利用碱基互补配对原则，将adapter连接到DNA片段上。Adapter不仅提供扩增和测序的引物序列，还包含用于标识不同样本的DNA barcode或index。 4️⃣ PCR扩增：通过PCR技术，将DNA样品浓度增至足够上机测序的水平。 𐟔줸Š机测序流程𐟔 1️⃣ 样品加载：将建库完成的样品加载到flowcell中，每个flowcell包含多个lane，每个lane内有许多tile。 2️⃣ 配对与扩增：样品中的P5序列与flowcell中的特定寡核苷酸接头配对，进行第一轮扩增。随后，新合成的P7'与tile内的5'配对，启动桥式PCR，形成相同序列的簇。 3️⃣ 测序反应：加入标记了荧光基团的A、T、C、G四种碱基，每次只允许一个碱基加入测序链。测序仪发出激发光，扫描荧光以识别碱基。每一轮结束后，通过化学反应改变碱基结构并去除荧光基团，为下一轮测序做准备。通过这一系列精细化的操作和控制，二代测序技术能够高效、准确地解读出DNA序列信息。𐟧좜耀

𐟧줺Œ代测序技术全解析𐟔 𐟔즭婪䤸€：DNA提取与质检纯净、足量、高质量的DNA是测序成功的基石。DNA可以来源于血浆或新鲜组织。 𐟧즭婪䤺Œ：DNA处理与文库构建通过一系列步骤得到特定长度的DNA片段，并加上接头，然后进行PCR扩增。 𐟎玲婪䤸‰：靶向捕获针对特定区域进行基因检测，提高测序效率。 𐟓š步骤四：上机测序根据测序仪的通量选择合适的仪器，上样后由机器自动完成测序过程。 𐟓Š步骤五：数据分析将测序得到的光强数据转化为序列信息，并进行初步、二级和三级分析，最终得到所需的数据解读。 𐟔此外，还有多种建库方法可供选择，如WGS全基因组建库、全外显子组建库等，以满足不同研究需求。 𐟒᤺Œ代测序技术以其高效、准确的特点，在基因组学研究中发挥着重要作用。了解其原理和流程，有助于更好地应用这一技术。

中山大学生物医学复试全攻略，快来看看吧！ 𐟎“ 复试准备 1️⃣ 自我介绍首先，请进行一个简短的自我介绍。内容可以包括你的姓名、专业背景、学术兴趣等。虽然不强制要求中英文，但建议选择英文以增加复试的多样性。 2️⃣ 文献总结接下来，请你阅读并总结一篇指定的文献。你需要从文章的目的、方法、结论三个方面进行概括，并朗读两三句以展示你的理解。 3️⃣ 英文问题回答准备回答两个英文问题：你的家乡是什么地方？为什么选择我们学校？ 4️⃣ 专业课问题你将面临一些专业课问题，例如：细胞膜表面的受体有哪些？高通量DNA测序的基本过程、原理和应用是什么？ 5️⃣ 随机提问最后，根据你提供的简历，可能会有一些随机提问，比如：你对你报考的专业了解多少？为什么选择考研？ 𐟒ᠥ䍨𐏨𔴥㫊在回答每一个问题时，尽量保持冷静，清晰地表达你的观点。准备好充分展示你的学术背景和热情。祝你好运！

Sanger测序：经典与现代的结合 𐟔Sanger测序，又被称为双脱氧链终止法，是一种由Frederick Sanger在1977年发明的经典DNA测序方法。因其高精度和在小规模测序项目中的广泛应用，至今仍被许多实验室所青睐。 𐟔쥟𚦜쥎Ÿ理：构建反应系统：Sanger测序包括四个独立的反应，每个反应都包含所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。ddNTP缺乏延伸所需的3-OH基团，因此当它们被DNA聚合酶掺入到正在合成的DNA链中时，会导致链的延伸在特定的碱基处终止。扩增目的片段：以目的片段为模板，在DNA聚合酶的催化下，从引物处起始开始复制DNA。当遇到ddNTP时，反应停止，产生一系列不同长度的DNA片段，每个片段的终止点由ddNTP决定。凝胶电泳：将这些终止的DNA片段通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离。由于凝胶对不同长度的DNA片段有不同的迁移速度，因此可以通过电泳将它们分开。序列读取：电泳后，通过检测凝胶上的荧光信号或放射自显影，可以读取DNA的碱基序列。每个ddNTP都有不同的荧光标记，因此可以通过荧光信号的不同来确定每个片段的终止碱基。 𐟓š应用领域： 𐟧짼–辑验证：用于验证CRISPR和TALEN等基因编辑技术的准确性。 mRNA制造质量控制：在mRNA疗法和疫苗生产中，用于序列确认。二代测序确认：作为正交方法，用来确认二代测序（NGS）鉴定的变异。微生物鉴定：通过16S rRNA Gene的Sanger测序进行微生物鉴定。 Sanger测序以其高准确性和可靠的结果，仍然是许多实验室和小规模研究的首选技术。尽管新一代测序技术在通量和速度上有所超越，但Sanger测序在特定应用中仍然不可替代。

DNA文库构建，一文读懂！嘿，大家好！今天咱们来聊聊DNA文库构建的那些事儿。其实，这个过程还挺有意思的，尤其是对于那些喜欢搞科研的小伙伴们。好了，废话不多说，咱们直接进入正题吧！片段化：第一步也是最关键的一步 𐟔ꊊ首先，咱们得把提取出来的DNA片段化。为什么呢？因为测序仪的读长有限，不能直接把整段DNA放进去测序。所以，我们需要把DNA剪切到适合的长度。现在常用的方法有两种：超声破碎法和酶切法。机械打断：操作复杂但效果不错 𐟔犊机械打断就是用一些物理方法把DNA打碎。虽然这种方法对样本的损耗比较大，操作也复杂，但它确实挺有效的。不过，市面上更常用的还是酶切法。酶切法：操作简便，成本低 𐟒𘊊酶切法就是用一些特定的酶来打断DNA。相比机械法，酶切法的成本更低，操作也更简便。你只需要加入片段化酶，然后反应一段时间就行了。目前常用的片段化酶是基于转座子原理的Tn5转座酶。 Tn5转座酶：背后的原理 𐟔슊Tn5转座酶最早是从E. coli中发现的一种细菌转座子。它的序列主要包括四个部分： IS50、IS50R和IS50L：这些序列高度同源。IS50R上的Tnp和Inh分别编码转座酶（Tnp）和转座抑制因子（Inh）。Inh可以和Tnp形成多聚体复合物，从而抑制Tnp介导的转座。 OE序列：由19个碱基组成，可以被Tnp识别，参与整个Tn5的转座。 IE序列：不参与Tn5的转座，但参与IS50的转座。耐药基因：Tn5上的耐药基因主要有kan、str和ble。总结 𐟓 无论是机械打断还是酶切法，最终的目的都是为了把DNA片段化，方便后续的测序工作。希望这篇文章能帮到你们，对DNA文库构建有个更清晰的认识！如果有任何问题或者想法，欢迎在评论区留言哦！

牛津纳米孔测序技术详解：从原理到应用牛津纳米孔测序技术是一种革命性的DNA测序方法，它利用纳米孔技术来读取DNA序列。以下是关于这项技术的详细介绍： 𐟔 电阻膜与DNA测序 ONT牛津纳米孔测序技术的核心是电阻膜，通过测量DNA分子在纳米孔中通过时引起的电流变化来推断DNA序列。这种方法适用于各种类型的DNA测序，包括全长cDNA测序、直接RNA测序以及基于连接反应的测序流程。 𐟓– 文库构建流程 ONT文库构建流程包括PCR-CDNA建库测序和直接RNA测序。PCR-CDNA建库测序适用于全长转录本和RNA修饰的研究，而直接RNA测序则可以直接获取RNA序列信息。 𐟔젥Ÿ𚤺Ž转座酶的DNA测序这种方法利用转座酶切割DNA，并在切割过程中加入一段序列。这段序列可以与带有马达蛋白的接头连接，从而实现快速文库构建。基于转座酶的DNA测序适用于超长测序、普通基因组测序、质粒测序和现场测序等多种应用。 𐟚€ 快速建库测序快速建库测序是一种高效的方法，可以在短时间内完成大量样品的测序。通过添加Barcode，可以实现多重样品的同时测序，大大提高了实验效率。 ONT牛津纳米孔测序技术在各个领域都有广泛的应用，无论是全长转录本的研究、RNA修饰的分析，还是基因组测序、质粒测序等，都能提供准确、高效的数据支持。

从零开始：ChIP实验的详细指南（上） 𐟔 ChIP实验的原理和应用在活细胞中，蛋白质和DNA的结合是动态的。为了固定这种结合状态，我们使用甲醛来交联蛋白质和DNA。通过超声或酶切将染色质打断成小片段，然后用抗体特异性识别目标蛋白结合的DNA片段，最后对DNA片段进行纯化和检测（如qPCR、基因芯片、高通量测序等）。 ChIP实验广泛应用于研究转录因子与DNA的结合动态，以及组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。 𐟌 细胞固定内源状态下，蛋白质和DNA的结合是动态的，因此需要进行固定以捕获特定状态下的结合情况。最常用的固定试剂是甲醛。甲醛是一种小分子，能够穿透细胞膜和核膜，通过醛基将DNA和蛋白质交联在一起。甲醛交联是可逆的，通过加热可以解除交联，从而方便后续的DNA分析。但是，甲醛交联反应需要一定的时间，作用距离小于2ㅯ𜌥﹨›‹白表位也会有影响。过长时间和过短时间的交联都不利于实验。因此，甲醛交联是ChIP实验的关键步骤。 𐟒ᠧ”𒩆›交联的小贴士细胞生长状态会影响基因表达网络，可能会影响所研究的TF与promoter的结合。因此，细胞长到75%-85%时最好，所需的细胞量为1～2X 107左右。在甲醛交联之前，细胞应尽可能少被人为处理。如果条件允许，直接将甲醛加入培养基中进行交联更好。务必使用有效期以内、正确避光保存的分析或分子生物学级别的甲醛。固定条件通常为室温（不要高于25℃）固定10-15 min。当DNA和靶点结合较弱时，可适当延长交联时间。进行预实验优化交联时间和温度。交联时间过长或温度过高会显著降低染色质超声破碎效率，且可能遮蔽ChIP抗体识别的表位。交联不足可能导致蛋白质和DNA解离。组织交联相比细胞更复杂，大的组织块交联之前切成1-3 mm3大小，建议在真空条件下交联，促进甲醛透过细胞，交联时间可延长至15 min。 𐟌쯸 细胞核抽提及裂解由于蛋白和DNA相互作用主要发生在细胞核内，因此去除胞浆蛋白可以减少背景信号并提高灵敏度。同时，分离的细胞核直接悬浮在剧烈的裂解缓冲液中，更有利于打开细胞核释放染色质。

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