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重悬最新娱乐体验_末世之三妻四妾(2024年12月深度解析)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：话题更新日期：2024-12-03

Transwell实验详解，测侵袭！体外Transwells小室趋化侵袭实验——24孔趋化小室(孔径8um) 𐟔 实验原理在Transwell实验中，上室种植肿瘤细胞，下室加入FBS或特定趋化因子。肿瘤细胞会向营养成分高的下室移动。与肿瘤细胞迁移实验不同，此实验在上室侧铺上一层基质胶，模拟体内细胞外基质。细胞欲进入下室，需先分泌基质金属蛋白酶（MMPs）降解基质胶，才能通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。 𐟓 实验方法大致流程 1️⃣ 将冻存的Matrigel胶在4℃冰箱中过夜解冻，使其液态化。 2️⃣ 用不含10%胎牛血清的RMPI1640培养液稀释Matrigel胶，按1:1的比例在冰水浴中混匀。 3️⃣ 将稀释后的Matrigel胶均匀铺在聚碳酸酯膜上，覆盖整个膜面，置入37℃恒温箱中静置30min-1h使其凝固形成基质屏障胶。 4️⃣ 将转染后收集的细胞或对照组细胞进行常规胰酶消化、PBS冲洗3遍。 5️⃣ 用不含10%胎牛血清的完全培养液重悬细胞，进行细胞计数并调整细胞密度至2.5㗱0^5个/mL。 6️⃣ 将形成基质屏障胶的膜用不含10%胎牛血清的RMPI1640培养液进行浸润水化。于上室加入处理后的细胞，24孔板小室一般加200⵬。 7️⃣ 在下室内加入含有20%优质胎牛血清的RMPI1640培养液进行细胞侵袭诱导，每个组设3个平行复孔。 8️⃣ 将小室在37℃、5%的CO2恒温培养箱中培养24h后，倒弃上室中的细胞及液体，并用PBS冲洗2遍。 9️⃣ 将上室内的Matrigel基质屏障胶用棉签擦去，滤膜上层贴壁生长但未能穿过膜的细胞。将上室置于95%乙醇室温固定30min。 𐟔Ÿ 将固定后的膜经结晶紫染色10~15min后，蒸馏水冲洗终止染色。 1️⃣1️⃣ 显微镜下随机挑选5个低倍视野(200X)的细胞计数，以其穿膜细胞的平均数作为细胞侵袭能力的参数，计算平均值。通过以上步骤，你可以评估肿瘤细胞的侵袭能力，进一步了解肿瘤细胞的生物学特性。

Raw264.7培养，你做对了吗？ 𐟌𑠧𛆨ƒž复苏步骤：预热培养液：将完全培养液放入37℃水浴锅中预热30分钟。准备离心管：在超净台内，吸取7毫升完全培养液至15毫升离心管中。解冻细胞：将细胞从干冰中取出，用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动，使细胞在1分钟左右完全融化。离心处理：将细胞悬液转移至提前准备好的完全培养液中，盖上盖子，以1100 rpm室温离心4分钟。重悬细胞：在超净台内吸弃上清，吸取1毫升完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，转移至装有4毫升完全培养液的T25 cmⲥŸ𙥅𛧓𖯼ˆ或6厘米皿）中，标记细胞名称、复苏日期、代次，放置于37℃、5% CO2培养箱中培养。观察细胞：第二天观察细胞状态及贴壁情况。 𐟔‘ 复苏关键点：操作时间：复苏操作时间不宜过长，尽量在15分钟内完成。细胞状态：若复苏后24小时细胞状态不佳或分化较多，建议再次复苏时将细胞接种到六孔板中。避免大容器：请勿直接复苏到T75 cmⲧ“𖦈–10厘米皿。 𐟌𑠧𛆨ƒž传代步骤：汇合度：当细胞汇合度达到70-80%时进行传代，传代比例为1:3-1:6。吸出原液：吸出原培养液，直接吸取新鲜完全培养液轻柔吹打成单个细胞，在显微镜下观察细胞是否为单个细胞。接种传代：按一定比例接种传代，第二天观察细胞状态。 𐟔‘ 传代关键点：胰酶消化：该细胞不可用胰酶消化。血清质量：血清质量差异可能会对细胞生长有影响，建议使用高级血清进行培养，如果没有高级血清，可提高血清浓度进行培养。控制传代间隔：通过传代可以改善细胞分化的比例，由于Raw264.7细胞生长速度很快，一般2-3天即可传代，因此传代间隔不能超过三天，若超过会使细胞更容易分化，分化的细胞贴壁牢固，难于吹下，所以需要控制好每次的接种密度。处理分化细胞：若分化细胞占比很大，待细胞长至70-80%汇合度后用单道移液器将表面未分化的圆形细胞轻柔吹下转移至新的培养板里并吹成单细胞（注意接种密度，不可过稀），只吹一下即可，避免把分化的细胞也一并吹下培养，之后2-3次传代如上述操作可得到正常的细胞。

如何调整菌液浓度？简单步骤教你搞定！今天来聊聊如何调整菌液的浓度。其实，浓缩菌液并不难，只要掌握几个关键步骤，就能轻松搞定。下面我就给大家详细讲讲。离心：让细菌沉淀𐟒‰ 首先，把你要浓缩的菌液转移到离心管里。然后，用离心机以适当的转速和时间离心，让细菌沉淀下来。一般来说，3000-6000 rpm离心10-20分钟就差不多了。离心完后，小心地把上清液倒掉或吸取掉，只留下沉淀的细菌。洗涤（可选）：洗掉杂质𐟧𜊥悦žœ你担心上清液里的残留物质会影响后续实验，可以选择用适量的新鲜缓冲液或培养基洗涤一下细菌沉淀。然后再离心一次，去掉洗涤液，保留细菌沉淀。重新悬浮：让细菌复活𐟌𑊦Ž夸‹来，用一定体积的新鲜培养基或缓冲液轻轻重悬细菌沉淀。为了达到所需的浓度，需要计算一下所需的总体积。假设你有1 ml原始菌液，其OD值为1时浓度为4㗱0^8 CFU/ml，现在你想得到5㗱0^9 CFU/ml的浓度。计算：4㗱0^8 CFU/ml 㗠1 ml = 4㗱0^8 CFU 然后，计算达到目标浓度所需的体积：4㗱0^8 CFU / (5㗱0^9 CFU/ml) = 0.08 ml 因此，你需要将细菌沉淀重新悬浮在0.08 ml的新鲜培养基中。混合均匀：让细菌分布均匀𐟔„ 确保细菌沉淀充分分散在新培养基中，可以用涡旋混匀器轻轻混合一下。验证浓度：确保无误𐟔슥œ觨€释和使用浓缩菌液进行实验之前，最好验证一下新的菌液浓度。你可以通过平板计数法或其他适当的方法来确认CFU/ml的数值。希望这些步骤能帮到你，如果有任何问题，欢迎随时交流哦！𐟘Š

划痕实验拍照几倍镜细胞划痕实验是一种简单而有效的方法，用于研究细胞的迁移能力。通过这种方法，我们可以比较不同细胞系的迁移能力，甚至探究药物对细胞迁移的影响。下面我将详细介绍这个实验的步骤和注意事项。实验前准备 𐟧𜊩斥…ˆ，准备好所有需要的实验器材，包括离心管、吸管筒、移液枪、枪头和直尺等。将这些器材放入无菌超净工作台，并用紫外线照射30分钟进行消毒。然后，用通风机通风3分钟，确保无菌环境。在无菌6孔板上用黑色记号笔划线 𐟖Š️ 用直尺比着，在6孔板底部均匀地划横线，每隔0.5到1厘米一道，每孔至少穿过3条线。每条黑线的上下缘与划痕交叉点作为观察点，这样便于观察和取多个数据。细胞准备 𐟧슥–出处于对数生长期的健康细胞，吸掉原来的培养液，用无菌PBS清洗细胞。加入1ml胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入完全培养基终止消化。收集细胞悬液于15ml离心管中，800rpm/min室温离心5分钟。用罗氏CASY快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数，弃去上清，加入培养基重悬细胞。以每孔1到4㗱0^5细胞的密度接种到6孔培养板上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养一天。直线划痕 ✏️ 取出铺满六孔板的细胞，用200ul枪头垂直于细胞表面，由孔一端划向另一端。尽量垂直于背面的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。此时可在培养皿的表面清晰看到细胞表面呈#字形划痕。 PBS清洗细胞及培养 𐟧𜊥𘦎‰旧培养基，用无菌PBS洗细胞表面3次，去除划下的细胞。加入含有1%胎牛血清的培养基为阴性对照，及含有相应浓度药物的1%胎牛血清培养基为药物刺激组；每组2个复孔。轻轻摇动六孔板，使药物与细胞培养液充分混合，放入37度，5%CO2培养箱中培养。结果观察 𐟔 分别取划痕0小时、24小时、48小时后观察不同处理组的痕道宽度。结果可见：细胞划痕后48小时观察到对照组细胞划痕宽度恢复约90%，而药物抑制组恢复约60%。表明加入药物后，由于药物的作用，使细胞迁移受到抑制，而未加入药物的细胞保持原有的迁移能力，在48小时后通过迁移将划痕掩盖。注意事项 ⚠️ 细胞密度：注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种密度，对不同的细胞要观察其贴壁率等，保证培养终止时密度适当。冲洗细胞缓慢轻柔：在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁缓慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。低浓度或无血清培养：划痕PBS冲洗后应该加入无血清培养基或者低浓度血清培养基，以排除细胞本身增殖对实验的影响。通过这些步骤和注意事项，你可以轻松地进行细胞划痕实验，探究细胞的迁移能力。希望这篇指南对你有所帮助！

人表皮角质形成细胞的传代培养指南 𐟧슨ᨧš于皮肤的外层，主要由胚胎时期的外胚层形成，具有抗摩擦和抗损伤的作用。表皮是皮肤的浅层结构，由复层扁平上皮构成，从基底层到表面可分为五层：基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。表皮角质形成细胞是一种能合成角质蛋白的上皮细胞，主要分布于表皮基底层。 𐟔젧𛆨ƒž传代步骤：细胞未长至85%时：用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到生物操作台内，严格无菌操作。打开细胞培养瓶，若培养瓶上无特殊标注，吸去剩余培养液，只留6-8ml培养液继续培养。细胞已长满（达85-95%）：弃去培养液，用PBS洗涤1-2次。加入1.0ml胰酶消化液，37℃消化（消化时间根据不同细胞及所用胰酶有差异）。显微镜下观察细胞消化情况，若细胞回缩变圆、透亮、轻拍瓶壁呈流沙样脱落，则迅速拿回操作台，加入至少双倍的完全培养液，终止消化并轻轻吹打细胞1-2次，使其变成单细胞悬液。将细胞收集于离心管中离心1000rmp/5min，弃上清，轻弹管底，将细胞弹散。加入新鲜培养基重悬细胞，进行传代。如果没有特别说明，建议收到细胞后的第一次传代比例为1:2。 𐟔젦𓨦„事项：观察细胞密度最好用4X物镜低倍镜观察，以便正确的判断细胞密度；观察细胞形态请用10X或20X高倍镜观察。推荐使用0.05%胰酶/EDTA消化液。瓶中运输的培养液不能重复使用，请换新鲜培养液培养。有些细胞贴壁不牢，如发现贴壁细胞有脱落，可离心重悬后接种到新瓶内。 𐟧𜠦𖈦𘎦“作：收到细胞后，请对细胞培养瓶外表进行消毒，将细胞置于培养箱中进行1-2小时的缓冲，待细胞恢复基本生长状态后，进行后续细胞实验。在倒置显微镜下观察整个细胞生长情况。

类器官免疫荧光染色全攻略𐟔좜芰Ÿ”젥ꌦ�꤯𜚊1️⃣ 回收：使用尖枪头轻轻刮下类器官，转移至EP管中，轻柔吹打使胶分离。室温下50g离心3分钟，去上清。加入10mL预冷的DPBS，轻柔吹打后再次50g离心3分钟。 2️⃣ 固定：去上清（不需要吸得很干净），加入4%多聚甲醛，4度静置固定1-2小时。然后去上清，用PBS重悬洗1-2次，静置5分钟后50g离心3分钟。 3️⃣ 打孔：弃上清，加入500 0.25% Triton X-100，室温处理30分钟。用1mL PBS洗2-3次，静置5分钟后50g离心3分钟。 4️⃣ 封闭：用10%山羊血清工作液封闭1小时。 5️⃣ 一抗二抗DAPI：进行一抗、二抗和DAPI染色。 6️⃣ 成像：将制好的样品转移至共聚焦小皿，待成像。 𐟔젨䇯𜚏lympus超高分辨率转盘共聚焦显微镜 (SpinSR10) 𐟔젚轴间隔：1 𐟔젦𓨦„事项：所有操作需轻柔，避免类器官损伤。

冻存液细胞冻存是个技术活，但只要掌握了正确的方法，就能确保你的细胞在液氮中安全过冬。下面就让我来带你一步步搞定这个过程吧！实验前准备 𐟧ꊩ斥…ˆ，你得确保程序降温盒已经恢复到室温。然后，准备好冻存液。冻存液的配方有两种： 70% DMEM + 20% 血清 + 10% DMSO 90% 血清 + 10% DMSO 配好之后，把第一种放在4℃冰箱里备用（可以保存一周），第二种则直接用。细胞冻存步骤 𐟧Š 润洗、消化、终止消化、离心：这些步骤和细胞传代差不多，就不赘述了。离心后弃去上清液，用冻存液重悬细胞。取出灭过菌的冻存管，把细胞悬液分装进去，每管1 mL。用封口膜封好管盖，在管口贴上一层白色胶布，并在胶布上标明细胞名称、代数和冻存时间（年-月）。把冻存管放进程序降温盒里，然后放进-80℃冰箱过夜。第二天，把程序降温盒取出来，把细胞转移到液氮罐里。最后，做好冻存登记，详细记录细胞在液氮罐中的具体位置。注意事项 ⚠️ 标记要清晰：用记号笔在冻存管管壁上标明细胞名称、代数、冻存者和日期，以防白色胶布脱落后无法识别细胞种类。拧紧盖子：把冻存管管盖拧紧，以免液氮进入冻存管，复苏时爆炸，防止复苏细胞时水进入冻存管内。定期检查液氮量：注意定期检查液氮罐内的液氮量，及时添加。补充异丙醇：及时添加程序降温盒中的异丙醇。希望这些步骤能帮到你，让你的细胞在液氮中安全过冬！如果你有其他问题或者需要更多细节，欢迎随时来问我哦！𐟧찟窀

如何制作漂亮的免疫荧光类器官图嘿，大家好！今天我想和大家分享一下如何做出超好看的免疫荧光类器官图。这个过程虽然有点繁琐，但绝对值得一试！让我们一起来看看吧！类器官收集 𐟌𑊩斥…ˆ，我们需要收集类器官。取出类器官培养板，用显微镜观察类器官的大小。等到类器官长到100-200左右的时候，就可以进行石蜡包埋了。用移液枪吸去培养液，加入等体积的预冷基础培养基。用润洗过的枪头（剪去尖端）轻轻划破或吹散基质胶和类器官的混合培养物，然后转移到1.5mL的离心管中，轻柔吹打几次，最后在冰上静置5分钟。接下来，300g，4℃，离心3分钟。你会看到培养基、基质胶和类器官沉淀从上至下分三层。如果基质胶去除不干净，可以再次用基础培养基重悬类器官离心后弃上清，直到基质胶完全去除。类器官固定、清洗 𐟧ꊥ›𚥮š类器官加入1mL 4% PFA到类器官沉淀悬液中，轻柔吹打使其混匀，然后在冰上或4℃静置固定1小时。固定结束后，300g，4℃离心5分钟，弃去上清。清洗类器官加入1mLPBS重悬类器官，300g，4℃离心5分钟，弃去上清。将类器官沉淀转移到60-70℃的水浴或金属浴中预热待用。琼脂糖包埋类器官 𐟧𔊥œ襾⧂‰中隔水加热至3%的琼脂糖彻底融化，操作时避免琼脂糖溶液沸腾，否则会导致液体损失及浓度改变。加入30-50已完全溶解的琼脂糖溶液，用润洗过的枪头（剪去尖端）重悬类器官沉淀，冰上放置30分钟，待其凝固。石蜡包埋、切片、脱蜡至水 𐟔ꊨ🙤𘀦�œ‰点复杂，但很重要。简单来说，就是将凝固的琼脂糖包埋的类器官切片，然后进行石蜡包埋、切片、脱蜡至水。免疫染色 𐟌ˆ 高温抗原修复封闭：用5%BSA封闭30分钟；孵育一抗：每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；孵育二抗：第二天加荧光二抗。PBST浸洗爬片3次，每次3分钟。吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1小时。PBS浸洗爬片3次，每次3分钟； DAPI染核：滴加DAPI避光孵育5分钟，对标本进行染核。PBS 5分钟㗴次洗去多余的DAPI；封片观察 𐟔튧”襐𘦰𔧺𘥐𘥹𒧈짉‡上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。好了，这就是制作免疫荧光类器官图的全过程啦！希望对大家有帮助！如果有任何问题或需要更多细节，欢迎留言讨论哦！

贴壁细胞传代实验全攻略细胞复苏步骤：首先，使用前用紫外线照射超净工作台30分钟，并用75%酒精擦拭台面，保持干净整洁。使用时一定要打开通风。将冻存细胞从-80度冰箱或液氮罐中取出，立即放入37℃恒温水浴中解冻，不停晃动以加速化冻。将化冻的细胞液转移至装有3mlDMEM完全培养基的5ml离心管中，吸打均匀。注意液体不要留在瓶口或瓶盖上，避免污染。复苏细胞时，离心机提前降温至4℃，以1000rpm的转速离心5分钟并弃上清（离心的速度和时间根据细胞系不同有所差异）。用3mlDMEM完全培养基重悬细胞，并转移至6cm细胞培养皿中，放入细胞培养箱。在显微镜下观察复苏细胞的状态，并及时（每48小时）更换DMEM完全培养基。当细胞密度占显微镜视野80%-90%时，进行细胞传代。贴壁细胞传代步骤：弃置原培养皿中的培养基，从培养皿边缘加入2ml预热的PBS平衡盐溶液润洗细胞（注意不要直接冲到细胞表面），并弃置。沿培养基侧壁加入1ml预热的0.25%（w/v）Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶完全覆盖细胞表面。于细胞培养箱中孵育2分钟（孵育时间根据细胞系不同有所差异，如不确定细胞消化时间，每隔1分钟取出在显微镜下观察，约有50-70%细胞飘起，即可继续操作）。向培养皿中加入1ml完全培养基中和Trypsin的作用，并轻轻吸打细胞表层数次。将细胞悬液转移到5ml离心管中，在室温下以1000rpm的转速离心3分钟。小心弃去离心管中的上清液，使用1ml完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，使其完全被吹打为单个细胞状态，尽量减少泡沫的产生。进行细胞计数后以1:3（1:3～1:6均可）的比例进行细胞传代。取三只新6cm细胞培养皿，每只培养皿中加入3ml完全培养基，将细胞悬液平均分配至三只培养皿中，盖上盖子后，按照画“十字”的操作，将细胞摇匀。将细胞培养皿放入细胞培养箱中，继续培养，每天观察细胞状态并及时更换培养液。

细胞迁移与侵袭实验全攻略 𐟔젥ꌧ›„ 通过 Transwell 小室实验，研究细胞的迁移与侵袭能力，以及不同因素对细胞该行为的影响。 𐟓– 实验原理细胞迁移与侵袭实验将 Transwell 小室放入培养板中，小室内为上室，培养板内为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。聚碳酸酯膜具有通透性，下层培养液中的成分可影响上室内的细胞。通过使用不同孔径和处理的聚碳酸酯膜，可进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等研究。 𐟧ꠥꌦ料可拍照显微镜 Transwell 小室（孔径 8） 24 孔板 BD 公司的 Matrigel 无血清 DMEM 含 1% 胎牛血清的 DMEM 和 1640 培养基 DMEM 完全培养基 1640 完全培养基（也可加到 20% 血清）无菌 PBS，棉签，胰酶，4% 多聚甲醛固定液或甲醇结晶紫染液（0.1% (g/ml) PBS 结晶紫） 𐟓 实验步骤基质胶铺板：用 BD 公司的 Matrigel 按 1:8 稀释，包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃ 30min 使 Matrigel 聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。制备细胞悬液：让细胞撤血清饥饿 12 - 24h，去除血清影响（非必须步骤）。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用 PBS 洗 1 - 2 遍，用含 BSA 的无血清培养基重悬，调整细胞密度至 5㗱0⁵/ml。接种细胞：取细胞悬液 100 加入 Transwell 小室。在 24 孔板下室加入 600 含 20% 血清的培养基，注意避免产生气泡。常规培养 12 - 48h（依癌细胞侵袭能力而定，24h 较常见）。结果统计：取出 Transwell 小室，弃去孔中培养液，用无钙的 PBS 洗 2 遍，甲醇固定 30 分钟，将小室适当风干。用 0.1% 结晶紫染色 20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用 PBS 洗 3 遍。在 400 倍显微镜下随机五个视野观察细胞，记数。 𐟓Š 实验结果记录显微镜下观察到的细胞迁移与侵袭的数量及分布情况。 𐟒젥ꌨ分析实验结果，探讨细胞迁移与侵袭能力的变化原因，以及实验过程中可能存在的误差和影响因素。

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