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DNA连接酶权威发布_dna连接酶和dna聚合酶的异同(2024年12月精准访谈)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：观点更新日期：2024-12-03

DNA连接酶

𐟔즞„建质粒载体的详细指南𐟧슰ŸŒˆ质粒载体的选择：首先，选择一个具备合适限制性酶切位点的质粒载体，这些位点将用于将插入片段整合到多克隆位点中。确保插入片段中不存在这些酶切位点，以避免片段被切开。 𐟌ˆ获取插入片段：DNA可以通过提取任何细胞或组织样品获得，或者通过PCR扩增。 𐟌ˆ酶切反应：扩增完成后，使用限制性内切酶对片段和载体进行酶切。 𐟌ˆ纯化质粒和片段：酶切后，通过电泳分离片段和载体，并使用凝胶纯化回收它们。 𐟌ˆ连接DNA片段：使用DNA连接酶将插入片段连接到质粒中。连接反应中，插入片段与载体的最佳比例为3:1，以确保少量载体自连。连接反应可以在14-25℃下孵育1小时或过夜。 𐟌ˆ转化细菌：通过热激法将连接后的质粒转化到细菌中，并将转化后的细菌涂抹在含有抗生素的琼脂板上，在37℃环境中培养过夜。由于质粒包含抗生素抗性基因，成功转化的细菌在抗生素存在下会生长形成菌落。 𐟌ˆ筛选克隆：从转化板中挑选多个单克隆，接种到含有培养基且已编号的管中，在摇床培养箱中进行扩增，并纯化质粒。 𐟌ˆ鉴定质粒：使用限制性酶切割质粒，并将酶切产物进行凝胶电泳，以检查插入片段的存在。证实转化了插入片段的质粒可用于扩大培养和测序。 𐟑颀𐟔쥜覕𔤸꨿‡程中，每个步骤都需要严格控制条件和操作规范，否则可能导致失败。只要按照这个流程认真操作，相信大家都能成功构建质粒载体！

分子克隆实战指南：PCR篇 𐟔奈†子克隆的目的是构建目的基因重组体，并在细胞中验证其成功过表达。以下是主要流程： 1️⃣ PCR：获取目的基因TP53基因的CDS区（1182bp），通过PCR并经琼脂糖凝胶电泳验证条带，然后胶回收目的基因。 2️⃣ 酶切：将目的基因与载体用特定限制性核酸内切酶切割，暴露粘性末端，并分别胶回收这两部分。 3️⃣ 连接：用DNA连接酶连接暴露粘性末端的目的基因和载体。 4️⃣ 转化：将连接成功的环状产物转化到大肠杆菌感受态细胞。 5️⃣ 涂板：12-16小时后挑菌做菌落PCR验证。 6️⃣ 摇菌：直接摇菌中提（见之前菌落PCR笔记，可以省去小提步骤）。 7️⃣ 提取质粒并测序。 8️⃣ 转染：将质粒转染细胞24小时后（记得要有对照组，即只转染试剂组）。 9️⃣ 提取细胞总RNA。 𐟔Ÿ 逆转录成cDNA。 1️⃣1️⃣ 设计qPCR引物（Primer bank查询即可）。 1️⃣2️⃣ 实时荧光定量PCR检测目的基因TP53。 ⚠️注意事项： 1️⃣ PCR试剂盒选择：实验室之前使用Takara的Primer star高保真酶，后期发现很多国货非常好用，如ATG巨匠生物的ATG 2*Proofast Master Mix，PCR结果稳定，酶高保真且扩增效率高。 2️⃣ PCR程序设定的两个关键问题：退火温度：与引物性质有关，注意设计引物软件中的Tm值不应算上酶切位点和保护碱基，应只含互补配对部分，这时的退火温度才是准确的。理论上一定范围内，退火温度高时，特异性好。所以很多同学碰到有杂带的情况，可以适当提高退火温度；反之，如果条带不出，可以适当降低退火温度。延伸时间：延伸时间与片段长度有关，还与酶的延伸效率有关，可以参见DNA聚合酶的说明书。 3️⃣ 通过胶回收获得的产物是未暴露粘性末端的双链DNA，所以还需要后续的限制性核酸内切酶进行酶切，将载体和目的基因片段都暴露粘性末端，才能进一步连接。

我想用DNA连接酶，将我缝进你的心里。我有三道防线，也不能将你免疫。晚安～

「邓为」❤️「邓为苏易水」❤️「邓为仙台有树」我想用DNA连接酶，将我缝进你的心里。我有三道防线，也不能将你免疫。 @邓为D𐟌𞨋易水[笑cry]邓为苏易水｜邓为涂山璟𐟒™邓为郑适[哈哈]涂山璟&郑适☘️邓为云起时[心]邓为叶十七/邓为仙台有树

CRISPR-sgRNA文库构建全攻略𐟔슰ŸŒˆ 实验目的掌握CRISPR-sgRNA文库构建的原理和操作步骤。构建针对特定基因的sgRNA文库，用于基因编辑研究。 𐟧ꠥꌦ料试剂𐟧ꊧ𛆨Œ感受态细胞（如DH5a） pUC57载体模板DNA 引物 dNTPs Taq酶 T4DNA连接酶限制性内切酶（如BsmBl或BbsI）琼脂糖磷酸缓冲液 70%乙醇无菌水仪器𐟔슐CR仪器琼脂糖凝胶成像系统微量移液器离心机恒温培养箱净化工作台 𐟓 实验步骤设计sgRNA序列𐟓 依据目标基因设计特异性sgRNA序列，避免脱靶。合成sgRNA模板𐟖‹️ 配制PCR反应体系：模板DNA：10 ng 引物：10 pmol/L dNTPs：0.2 mM Taq酶：1U 磷酸缓冲液：5 无菌水补足至50 进行PCR反应： 95℃预变性5 min 95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环 72℃延伸10 min 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物𐟔슥‡†备1.5%琼脂糖凝胶。与DNA marker一起电泳。观察确认产物大小正确。切割载体✂️ 用限制性内切酶切割pUC57载体。琼脂糖凝胶电泳检测切割效果。连接sgRNA模板与载体𐟔— 将PCR产物与切割后的载体进行T4 DNA连接。 16℃过夜连接。转化感受态细胞𐟦 连接产物与感受态细胞混合，冰浴30 min。 42℃热激90 s。冰浴2 min。加入适量LB培养基，37℃培养1 h。筛选阳性克隆𐟔 挑取单个菌落进行PCR验证。确认阳性克隆后提取质粒。测序验证𐟔⊦取的质粒测序验证sgRNA序列是否正确。 ⚠️ 实验注意事项保持无菌环境防止污染。 PCR防止引物二聚体产生。内切酶切割载体确保完全切割。转化感受态细胞注意热激时间控制。

详细步骤！构建重组载体与连接转化全攻略构建重组载体是基础实验之一，必须掌握。以下是详细步骤：连接步骤（T4 DNA酶连接法）：将7ul的目的片段、1ul的载体骨架、1ul的buffer和1ul的T4 DNA连接酶混合（如图2）。在16度下连接8小时，或25度下连接2小时（如图3的仪器）。转化步骤：从-80度冰箱取出一管感受态细胞，放在冰上静置3分钟，待其变为半透明状。吸出50ul到新的预冷离心管中，剩余的感受态细胞可立即放回-80度冰箱，下次继续使用。将连接产物缓慢加入感受态细胞中，以上两步均在超净台中完成。冰上静置30分钟。 42度热激90秒。冰上静置2分钟。在超净台中加入400ul无抗的2YT液体培养基。在摇床上摇45分钟至1小时。准备涂布棒，在酒精灯上灼烧后静置冷却（如图5）。摇好的菌液涂在有抗性的固体培养皿中的培养基上（上一篇笔记有详细说明），一般涂100ul左右，具体根据载体而定。用涂布棒旋转涂均匀干燥即可（在超净台中完成）。将培养皿倒置放在37度培养箱中培养过夜，等待检测结果。希望大家的科研顺利！𐟒—

❣️✐.𐟔†✐ ᵕ술CHENGYI𐟍ƒ𐝔𜰝•Ÿ𐝕›𐝕 𐝕ꠦˆ‘想用DNA连接酶，将我缝进你的心里。我有三道防线，也不能将你免疫。 ℋᵅᵖᵖᵞ♡ᵕ숪 ᙚᵐⁱᒻᵉ⨌ᠥ”䯸@成毅「成毅赴山海」cy「成毅萧秋水李沉舟肖明明」成毅｜赴山海｜肖明明｜萧秋水｜李沉舟｜莲花楼｜李莲花｜李相夷｜深潜｜云弘深｜卢云｜

𐟧쨴觲’载体构建的三大方法𐟔슦‹🥈𐧛„基因后，如何高效地将其克隆到质粒载体上呢？这里介绍三种主流的载体克隆方法： 1️⃣ T4连接酶法𐟔—：首先，使用相同的限制性内切酶同时双酶切质粒载体和目的片段，使两端产生黏性末端。然后，利用T4连接酶进行连接。注意保护酶切后的黏性末端，避免破坏。 2️⃣ 无缝克隆法（同源重组）𐟧쯼š 这种方法需要线性化载体与目的片段带有20bp左右的同源臂。通过5’端核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的共同作用，实现载体的无缝克隆。优点是连接效率高，且阳性率高。 3️⃣ PCR法克隆载体𐟒‰：最经典的是环PCR对质粒进行点突变，可以删除或添加序列到载体上。CR还能连接长片段到载体上，完全脱离了酶切位点的限制。这三种方法各有特点，选择哪种取决于你的具体需求和实验条件哦！𐟧ꀀ

质粒克隆：无缝克隆与T4法的关键区别在分子生物学中，质粒克隆是构建基因工程载体的重要步骤。𐟔찟笠无缝克隆法和T4法是两种常见的质粒克隆技术，它们各有千秋，适用于不同的实验需求。无缝克隆法，也称为同源重组法，利用同源重组酶来实现质粒与目的片段的连接。𐟔„ 这种方法的原理在于，线性化载体与目的片段通过20bp左右的同源臂进行互补配对，然后利用DNA聚合酶补齐碱基，最后通过DNA连接酶连接上两个切口。无缝克隆法的关键在于其产生的超长3’突出末端，这20bp的同源臂可以视为一个长黏性末端进行互补配对。相比之下，T4法使用相同的限制性内切酶双酶切载体和目的片段，产生相同的黏性末端，然后使用T4连接酶进行连接。𐟔— T4法产生的黏性末端一般仅有2-4bp，这使得它在连接小片段时更为高效。无缝克隆法和T4法的主要区别体现在以下几个方面：连接目的片段的能力：无缝克隆法的20bp同源臂能够固定更长的目的片段进行连接，适合连接超过1000bp的目的片段。而T4法更适合连接短片段，通常不超过2000bp。容错率：无缝克隆法的超长末端虽然提高了连接的稳定性，但也增加了非正常配对的可能性。当同源臂或其两侧出现可以自身互相碱基配对的序列时，连接反应可能会受阻。这种情况虽然是小概率事件，但偶尔会导致连接失败。T4法则由于黏性末端较短，难以发生错误的配对。操作简便性：T4法操作相对简单，适合初学者。无缝克隆法则需要一定的实验技巧和经验，以确保实验的成功。在选择无缝克隆法还是T4法时，应根据实验目的和条件来决定。对于需要连接长片段或对容错率有严格要求的研究，无缝克隆法可能更为合适。而对于短片段的连接或需要快速得到结果的实验，T4法则是一个更便捷的选择。𐟏…𐟔쀀

如何确定circRNA的下游功能靶点LIG1？组学发现：作者通过RNA-seq技术，检测沉默circRNA的PANC-1/GEM耐药株细胞与对照细胞，发现739个差异基因，包括520个上调基因和219个下调基因。这些差异基因在多种DNA损伤修复通路中富集，包括碱基切除修复、错配修复和核苷酸切除修复。在这些通路中，包含显著下调的共同基因LIG1。LIG1是DNA连接酶家族的成员，在几乎所有DNA损伤修复通路中发挥着重要作用。应答检测：在GEM抵抗的PDAC组织中，LIG1也高度表达，并且与PDAC组织中的circRNA表达呈正相关。沉默circRNA后，LIG1的mRNA和蛋白表达水平降低，而过表达则增加LIG1的表达。回复验证：通过体内和体外实验证实，LIG1能够逆转circRNA对细胞增殖、凋亡和DNA损伤的影响。沉默LIG1会导致细胞增殖减少、凋亡增加和DNA损伤增加，而过表达LIG1则能够逆转由circRNA沉默引起的这些变化。结论：circRNA通过诱导LIG1的表达来减少DNA损伤、促进细胞增殖和降低凋亡，从而增强细胞对GEM的抵抗性。全文分享：【《Molecular Cancer》文献解读：巧用IP/RIP/ChIP/ChIRP探究circRNA促进胰腺AI耐药的调控网络】。 #科研#⠂ ⠣RNA测序#⠂ ⠣研究生#⠂ #实验外包#

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