当前位置：网站首页 » 导读 » 内容详情

emsa实验原理新上映_emsa实验原理竞争探针(2024年11月抢先看)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：导读更新日期：2024-11-28

emsa实验原理

EMSA实验常见问题及解决方法 𐟅𞯸 探针标记效率低问题描述：探针标记效率低会导致实验信号微弱，难以检测。 𐟉 解决方案：优化标记条件，如调整反应时间、温度和pH值，以提高标记效率。尝试不同的标记方法和试剂，找到最佳条件。标记后，使用凝胶电泳或荧光光谱仪检测标记效率。 𐟅𞯸 样品处理不当问题描述：样品处理不当可能减弱或消除蛋白质与核酸的结合信号，或产生非特异背景信号。 𐟉 解决方案：仔细阅读并遵循实验指南，确保按正确步骤处理样品。使用适当的缓冲液和条件稀释和准备样品，确保蛋白质与核酸形成稳定复合体。处理样品时，特别注意防止降解或污染。 𐟅𞯸 背景信号干扰问题描述：背景信号可能掩盖真实的蛋白质与核酸结合信号，影响结果解释。 𐟉 解决方案：进行对照实验，如不加荧光标记物或蛋白质的对照，评估背景信号水平。使用特异性更高的探针或抗体，减少非特异性结合产生的背景信号。分析数据时，设置合适阈值，区分真实信号和背景信号。 𐟅𞯸 凝胶浓度选择不当问题描述：凝胶浓度影响蛋白质与核酸结合的分辨率和灵敏度。浓度过低可能难以分辨结合信号，浓度过高可能导致蛋白质移动时受阻。 𐟉 解决方案：进行预实验，尝试不同凝胶浓度，找到最佳浓度。参考已发表文献或数据库信息，了解类似实验中使用的凝胶浓度。条件允许时，使用梯度凝胶电泳，观察不同浓度凝胶对结合的影响。 𐟅𞯸 非特异性结合问题描述：非特异性结合可能导致背景信号高，干扰特异性结合的判断。 𐟉 解决方案：使用特异性更高的探针或抗体，减少非特异性结合。加入竞争剂（如过量的未标记探针或无关蛋白），评估非特异性结合程度。分析数据时，注意区分特异性结合信号和非特异性结合信号。

DAP-seq常见问题解答，一文搞定！ 1. 𐟔 DAP-seq技术原理与流程技术原理：DAP-seq通过体外表达蛋白与DNA进行亲和纯化，洗脱后进行高通量测序，从而找到转录因子的结合位点。技术流程：构建含有亲和标签的载体，体外表达转录因子与亲和标签的融合蛋白，提取基因组DNA并构建DNA文库。将体外表达的转录因子与DNA文库结合，洗脱后上机测序。解决的问题：快速定位转录因子的结合位点，发现转录因子调控的靶基因。 𐟓š 所需材料组织材料或提取好的基因组DNA 目标蛋白质粒（含有完整目标蛋白序列的质粒，如转录因子） 𐟓ˆ 实验成功率不同转录因子家族的成功率有所不同，具体成功率可参考相关资料。 𐟔„ 重复次数实验包含两个技术重复，以确保结果的可靠性。 𐟌𑠦䍧‰駻„织样本要求植物组织样本的取样时期和部位根据研究需求确定，不同组织和时期DNA的修饰可能影响蛋白与DNA的结合。 𐟔전AP-seq与ChIP-seq的区别 DAP-seq不需要针对每个转录因子制备特异性抗体，具有快速、高通量和节约时间成本的优势。 𐟓Š Input对照 Input对照用于降低背景噪音，是亲和纯化前的文库。 𐟓Œ Peak数目少的结果可用吗？虽然DAP-seq的peak数目较少，但建议仍然对现有结果进行分析，可能挖掘出亮点结果。 𐟔젩ꌨAP-seq结果 DAP-seq结果一般需要验证，验证手段包括EMSA、酵母单杂等实验。如果通过前期大量转录因子筛选出候选转录因子，也可以考虑体内ChIP等验证。

EMSA实验全攻略：从交联到检测 𐟧ꠤ𚤨”步骤：使用紫外交联仪，选择254nm紫外波长，120mJ/cmⲯ𜌤𚤨”45-60秒。如果没有紫外交联仪，可以用普通手提式紫外灯，距离膜5-10厘米照射3-10分钟。或者使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米照射3-15分钟。最佳的交联时间可以通过标准品自行摸索。交联完毕后，可以直接进行下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进行下一步检测。如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考上述条件再交联一次，以进一步改善交联效果。 𐟒ᠥŒ–学发光法检测生物素标记的探针：将封闭液和洗涤液在37-50℃水浴中溶解。取15ml封闭液加入合适的容器中，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。取7.5 Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。取15ml洗涤液(5X)，加入60ml重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成75ml洗涤液。将尼龙膜转移至另一装有15ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。去除洗涤液，加入15ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。重复上一步骤三次（共洗涤四次），每次洗涤时间都约为5分钟。将尼龙膜转移至另一装有20ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。取2.5ml BeyoECL Moon A液和2.5ml BeyoECL Moon B液混匀，配制成BeyoECL Moon工作液。取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共5ml BeyoECL Moon工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2-3分钟。取出尼龙膜，进行显影观察结果。

EMSA实验揭秘：凝胶迁移 𐟌 凝胶电泳：在开始EMSA实验之前，首先需要制备6.5%的凝胶。与常规的凝胶电泳不同，EMSA实验无需分离胶和浓缩胶。在加入10%的过硫酸铵（AP）之前，确保凝胶在室温下静置10分钟以去除气泡。然后，加入10%的AP并混匀，灌胶。 𐟔砩℧”𕦳𓯼š 在加样电泳之前，进行预电泳以去除残余的杂质。使用预冷的0.5㗔BE缓冲液，以100V恒压电泳30-60分钟。预电泳过程中，用移液器反复冲洗上样孔3-5次。 𐟧ꠥˆ𖦠𗯼š 根据表格中的mix配方，配置反应体系。由于样品数量较多，建议使用mix混合液以减少加样误差并节省操作时间。将配置好的反应体系分装到标记好的PCR管中，依次加入双蒸水、核蛋白和生物素标记的探针，室温孵育10分钟。 𐟚€ 上样：孵育结束后，加入5的Loading Buffer，轻轻吹打混匀，准备上样。在电泳结束前，配置好0.5㗔BE电转移缓冲液并放置于冰箱预冷。将样品加载到样品孔中，以100V恒压低温条件下电泳45分钟，至指示剂到达胶的2/3处。 𐟌 转膜：电泳结束后，小心地从电泳装置中移走一片玻璃片，去掉样品孔的凝胶。将凝胶与另一片玻璃一起移入装有0.5㗔BE的盒子中，让凝胶与玻璃板分离并漂浮在缓冲液中。 𐟔砦𕸦𓡤𘎨𝬥𐯼š 将尼龙膜、同胶一样大小的厚滤纸及海绵垫在0.5㗔BE中浸泡10分钟。在转印夹的黑色面板中心依次放置海绵垫、至少3层印迹滤纸、转印膜、胶和至少3层滤纸。用玻璃试管在滤纸上轻轻滚动，以驱赶气泡。 𐟔頤𚤨”：将装配好的电转移夹放入电转移槽中，在0.5㗔BE中以100V恒压转45分钟。转膜结束后，将膜放置于干净滤纸上，膜正面朝上，放置在紫外灯下10厘米处，交联20分钟，交联前保持膜湿润。

EMSA实验探针设计八大原则，你知道吗？ EMSA实验中，探针设计至关重要，以下是探针设计的八大原则：序列选择 𐟧슩€‰择包含目标结合位点的DNA或RNA序列作为探针，这是实验成功的关键。结合位点 𐟔— 确定目标蛋白质的结合位点核心序列，有助于准确识别和定量结合反应。互补性 𐟤 探针序列应与目标结合位点互补，形成稳定的双链结构，确保实验准确性。标记方式 𐟌Ÿ 常见的标记方式包括放射性同位素标记、荧光标记、生物素标记等，选择适合的标记方式可以提高实验灵敏度。长度和纯度 𐟓 探针长度不宜过长，以免增加结合复杂性；同时，确保探针的纯度，避免杂质干扰结合反应。负对照 𐟚늨𘀤𘪤𘎧›‡结合位点不相似的负对照探针，验证特异性结合，确保实验结果的特异性。敏感性和稳定性 𐟔犩€š过优化探针浓度、反应条件和电泳条件，确保实验结果的准确性和可重复性。遵循这些原则，你的EMSA实验将更加精确和可靠！

EMSA凝胶迁移实验全攻略𐟓–✨ 𐟌ˆ 探索EMSA凝胶迁移实验的奥秘，这里有一份详尽的实验笔记等你来发掘！ 𐟒報. GST/His-a融合蛋白的纯化步骤：在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的磁珠，4℃摇床上缓慢摇动30~60 min。 4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，磁珠上结合了GST/His-a融合蛋白。加入500 预冷的PBS溶液，轻晃悬浮珠子，4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，重复此步骤3次。最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST/His-a的磁珠。 𐟔젲. 探针的标记：使用生物素标记EMSA探针。 𐟓Š 3. EMSA结合反应：根据实验需求进行EMSA结合反应。 𐟔破. EMSA胶的配制以及电泳：制备4-6%非变性聚丙烯酰胺凝胶。加样前先在0.5X TBE buffer中80V预电泳10 min，预电泳完毕后冲洗加样孔。混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。恒压80V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3 cm为止（大约50-60 min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长，温度不能超过30℃）。 𐟌 5. 转膜：在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，尼龙膜（至少提前10 min 侵泡），滤纸和纤维垫。按顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒流250mA转膜1h（注意根据实际情况调整电流及时间）。转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干燥。 𐟌Ÿ 6. 交联：紫外交联：转完后的膜，放入方皿中，在紫外灯下交联3-10 min（具体时间根据实际调整）。 𐟒ᠷ. 化学发光法检测生物素标记的探针：室温封闭15 min。加入适量的Streptavidin-HRP Conjugate，室温孵育15 min。洗涤3次，每次5 min。按1：1的比例将ECL发光液均匀滴到膜上。曝光，显影，定影。 𐟔 下回我们将分享EMSA实验结果分析，敬请期待！

𐟧쎆-KB p65活性检测大揭秘𐟔 𐟔즠𘨽쥽•因子NF-kappaB（NF-kB）可是个大家伙，它参与调控炎症、抗凋亡、肿瘤形成等好多重要过程呢！其中，p65(RelA)这个亚基可是个关键角色。 𐟒᤽ 知道吗？p65和其他几个亚基，比如p50、p49（也被称为p52）、p75（c-Rel）和p68（RelB），一起构成了NF-kB的大家庭。它们有的起反式激活作用，有的则具有DNA结合活力。 𐟔检测NF-KB p65的活性，其实就是要看看这个亚基是否在细胞核中活跃地与DNA结合。我们可以通过一系列复杂的实验，比如凝胶迁移实验，来观察这一过程。 𐟒‰在凝胶迁移实验中，我们会用到纯化的蛋白或者细胞核抽提物，然后在特定的条件下，让NF-kB与DNA结合。如果p65活性高，那么就会形成特定的凝胶迁移复合物，我们就可以通过电泳和染色来检测到它。 𐟓Š最后，我们还可以利用不同形式的NF-KB p65抗体，来捕获细胞核蛋白并加以区分。通过酶标仪450nm处的吸光度值测定，我们可以定量比较目的蛋白的活化度，从而得出一个明确的结论。 𐟎‰这样，我们就可以轻松地检测出NF-KB p65的活性啦！是不是感觉很有趣呢？快来试试吧！

𐟧짐𜨄‚糖凝胶电泳实验全攻略✨ 𐟔 你是否在琼脂糖凝胶电泳实验中感到迷茫？别担心，这里有一份详尽的教程等你来拿！ 𐟌᯸ 实验原理：琼脂糖凝胶电泳是利用电场使带电的生物分子在琼脂糖凝胶中移动。DNA和RNA分子因带有负电荷，会在电场作用下向正极移动。分子大小和形状决定迁移速度，小分子快，大分子慢。 𐟓 实验步骤： 1️⃣ 制备琼脂糖凝胶： - 称取琼脂糖粉末，加入电泳缓冲液，加热至溶解。 - 将溶液倒入模具，插入梳子形成样品孔，冷却后取出梳子。 2️⃣ 样品准备： - 将DNA样品与上样缓冲液混合，通常含有染料以便观察。 3️⃣ 电泳运行： - 将凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液。 - 加入DNA样品，连接电源，使用90-150V电压进行电泳。 4️⃣ 结果观察： - 电泳后，取出凝胶，用染料染色。 - 在紫外灯下观察DNA条带的位置和大小。 𐟒ᠥ𚔧”诼š 琼脂糖凝胶电泳广泛用于分子生物学和生物化学研究，如DNA分离和分析、回收以及基因组研究等。 𐟑 优点：操作简单，成本低，能有效分离不同大小的DNA片段。 𐟑Ž 局限性：分辨率有限，对于小或大分子分离效果不佳；染料如溴化乙锭具有致癌性，需注意安全。 𐟒ꠧŽ𐥜襰𑥊覉‹试试吧！让琼脂糖凝胶电泳成为你的科研利器！

彗星电泳实验全流程详解，轻松上手！ 𐟔젥ꌥŽŸ理：彗星电泳实验基于凝胶电泳技术，利用DNA或其他生物分子在电场中的迁移速度差异进行分离。样品加载到凝胶中后，带负电荷的分子向阳极移动，而带正电荷的分子向阴极移动，形成不同长度的带状图案。这些带状图案中，尾部呈现延伸状，类似彗星，故得名彗星电泳。通过观察这些带状图案，可以评估DNA损伤与修复、细胞凋亡等生物学过程。 𐟓 实验步骤： 1️⃣ 准备细胞：将细胞铺于六孔板中，待其生长到80%-90%的密度，收集细胞并进行计数，然后使用PBS缓冲液将其稀释至每毫升含有100个细胞。 2️⃣ 玻片制备：使用PBS缓冲液分别制备20毫升含有0.5%正常熔点琼脂糖（NMPA）和0.5%低熔点琼脂糖（LMPA）的溶液。 3️⃣ 第一层胶制备：将载玻片浸入煮沸的正常熔点琼脂糖溶液中，取出后擦拭去背面的琼脂糖，放入60摄氏度烤箱中过夜，随后在室温下保存。 4️⃣ 第二层胶制备：将准备好的0.5%低熔点琼脂糖溶液放入37摄氏度的水浴锅中备用。取100微升该溶液，加入10微升细胞悬液（约含有1000个细胞），充分混合后，滴在第一层胶上，盖上新的载玻片，用力压平。放置在4摄氏度下1-3分钟以固化。 5️⃣ 裂解细胞：将玻片缓慢浸入新鲜配制的冰冷细胞裂解液中，保持在4摄氏度条件下裂解2小时。 6️⃣ 碱化处理及电泳：将玻片取出，置于水平电泳槽中（正极端），并排放置，确保无空隙。倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液，使其高出胶面2毫米，避免气泡存在。放置10至30分钟，通常选用15分钟，以使DNA解链。设定电压为25V，电流为300mA，进行20分钟的电泳。 7️⃣ 中和：切断电源，取出玻片并置于染缸中，用中和缓冲液（Tris-HCl）浸洗，每次5分钟，共重复3次。 8️⃣ 染色：在中和后，将玻片晾干至中性状态。然后使用20ul至50的PI应用液进行染色，并盖上新的盖玻片。 9️⃣ 镜检：染色后的DNA样品应尽快在荧光显微镜下进行观察。未受损的细胞表现为圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。而受损的细胞则呈现出彗尾朝向阳极的形态，形成明亮的头部和尾部。通过以上步骤，你就能轻松完成彗星电泳实验，观察DNA的损伤与修复情况啦！

彗星实验：探索DNA损伤的神奇方法 𐟌Ÿ 彗星实验，听起来有点科幻，但其实它是一种非常实用的科研方法。由Ostling等于1984年首次提出，这个方法通过检测DNA链的损伤来评估遗传毒性。简单来说，它能够有效地告诉你细胞中的DNA是否受到了损伤，以及损伤的严重程度。基本原理 𐟌 当细胞受到各种内源性和外源性因素的攻击时，DNA链可能会断裂。这些断裂会破坏细胞的超螺旋结构，导致细胞膜、核膜等膜结构受损。在细胞裂解液的作用下，细胞内的蛋白质、RNA等成分会扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大，无法进入凝胶而留在原位。在中性条件下，DNA片段可以进入凝胶并发生迁移。而在碱性电解质的作用下，DNA会解螺旋，损伤的DNA断链和片段会被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA向正极迁移，形成“彗星”状图像。未受损伤的DNA则保持球形。实验方法 𐟧ꊊ现在市面上已经有较为成熟的彗星实验分析试剂盒，但你也可以自行配置梯度凝胶。实验的大致流程如下：样品处理：培养细胞，诱导凋亡，然后消化细胞，用PBS洗2次，并制成单细胞悬液，细胞浓度为2X105个/ml。制备第一层胶：取200ml 0.5%常温熔点胶（45C左右），加盖盖玻片，4C固化10min。制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，取50 1%低熔点胶（37C）和50细胞悬液混匀后滴加在第一层胶上，加盖盖玻片，4C固化10min。制备第三层胶：小心去除盖玻片；取75 0.5%低熔点胶（37C）滴加在第二层胶上，加盖盖玻片，4C固化10min。裂解：裂解去掉盖玻片，将凝胶浸人预冷的碱性裂解液内（临用前加10%DMAO，1%Triton X-100），4C裂解1h。漂洗：取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加人碱性的电泳缓冲液（pH 10），没过玻片约2~3mm，放置20min。电泳：以电压25V，电流300mA，电泳20min。漂洗：取出玻片，用PBS（pH 7.5）漂洗后，置于中和液2次，每次15min。染色：染色胶上滴加50 EB，加盖盖玻片，染色10min。阅片：荧光显微镜下观察并拍照片。通过这些步骤，你就能看到细胞的“彗星”图像，进而判断细胞的DNA损伤情况。这个方法不仅灵敏度高，而且操作相对简单，是科研工作中非常有用的工具。

专栏内容推荐

2686 x 2616 · jpeg
凝胶迁移实验（EMSA）
素材来自:plant.biorun.com
474 x 528 · jpeg
EMSA凝胶迁移实验技术服务-生物素标记-钟鼎生物
素材来自:zoonbio.com

600 x 189 · png
凝胶迁移（EMSA）实验详解 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com

964 x 499 · png
DNA/RNA EMSA 凝胶电泳迁移实验-技术专题-广州赛诚生物科技有限公司-服务于您的核心利益！
素材来自:gzscbio.com

600 x 281 · jpeg
凝胶迁移（EMSA）实验详解 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com

640 x 360 · jpeg
凝胶迁移实验（EMSA）原理、实验步骤 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com

864 x 241 · png
EMSA凝胶迁移实验原理介绍
素材来自:uptbio.com

474 x 266 · jpeg
凝胶迁移实验（EMSA）原理、实验步骤 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com

1207 x 529 · png
验证核酸-蛋白相互作用 | 凝胶迁移EMSA实验流程及结果分析 - AIGC资讯 - AIGC观察
素材来自:aigcdaily.cn

554 x 411 · jpeg
一文搞定凝胶迁移实验（EMSA） - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com
720 x 452 · png
凝胶迁移实验（EMSA）实验方法 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com

600 x 345 · png
凝胶迁移（EMSA）实验详解 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com
550 x 446 · png
凝胶阻滞迁移电泳检测服务（EMSA） - 安必奇生物
素材来自:abace-biology.com

474 x 167 · jpeg
EMSA凝胶阻滞实验原理及报告解析 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com

3334 x 1102 · jpeg
凝胶迁移实验（EMSA）
素材来自:plant.biorun.com

600 x 248 · jpeg
EMSA凝胶阻滞实验原理及报告解析 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com

1500 x 844 · png
EMSA凝胶迁移实验|wb检测|核酸蛋白互作试剂盒 - 金开瑞
素材来自:genecreate.cn

600 x 796 · jpeg
凝胶阻滞实验 EMSA实验流程和原理 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com
693 x 872 · jpeg
EMSA凝胶阻滞实验原理及报告解析 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com

500 x 380 · jpeg
EMSA凝胶迁移实验|wb检测|核酸蛋白互作试剂盒 - 金开瑞
素材来自:genecreate.cn
560 x 302 · jpeg
简要区分EMSA、染色质免疫共沉淀、免疫共沉淀、免疫沉淀、pull-down实验 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com