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质粒提取试剂盒在线播放_质粒提取试剂盒天根(2024年11月免费观看)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：导读更新日期：2024-11-29

质粒提取试剂盒

酵母菌落鉴定：两种方法优缺点大比拼在进行酵母菌落鉴定时，我们通常会选择两种方法：酵母质粒提取后鉴定和反复冻融法。以下是这两种方法的详细介绍及其优缺点比较：酵母质粒提取后鉴定 𐟧슦Œ‰照酵母质粒提取试剂盒的说明书进行操作，主要使用裂解液和破壁酶来破壁酵母细胞，然后通过提取到的质粒作为模板进行PCR。优点：鉴定效果显著，能够有效进行阳性鉴定。缺点：耗时较长，操作复杂。反复冻融法 ❄️ 将收集的菌落加100ul水重悬后，在98℃和液氮之间往返3次，每次在98℃和液氮中分别进行5min。优点：省时省力省钱，操作简便。缺点：如果破壁不完全，可能会错失阳性菌，如图中的基因4和基因5。大家可以根据实际情况选择合适的方法，祝实验顺利！

质粒提取全攻略：从摇菌到纯化，轻松搞定！嘿，科研小伙伴们！今天我要给大家分享一下质粒提取的全过程，从摇菌到纯化，每一步都详细到让你轻松上手！𐟑颀𐟔찟窊 𐟔젦‘‡菌培养：首先，你需要一个经过鉴定的克隆菌液。在LB固体平板上涂布，然后放入37℃恒温培养箱，耐心等待12-17小时，直到菌落清晰可见。准备好含抗生素的LB液体培养基，挑取单个克隆菌落，放入培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。 𐟌€ 收获细菌并裂解：离心扩增好的菌液，按照说明书重悬，转入1.5ml离心管中。使用质粒小量抽提试剂盒，按照说明书操作，轻松提取质粒。 𐟧젨𔨧𒒄NA的纯化：细菌裂解后，高速离心1分钟，彻底去除上清。按照试剂盒说明，加入溶液I、II、III，温和混合，离心分离，质粒就在上清中啦！ 𐟓 注意事项：确保每一步操作都无菌，避免污染。裂解时不要过于剧烈，以免破坏质粒。洗脱液的加入要准确，确保质粒完全溶解。

分子克隆实验指南：从零开始到成功大家好！首先，非常感谢你们的关注和喜欢，真的很开心我的笔记能帮到大家。还记得最开始的那篇笔记，记录了我那次离谱的分子克隆实验，4个片段的同源重组竟然花了两个月！后来我慢慢发现，分子克隆其实非常微妙，有点像高中时的数学，学霸们轻而易举考100分，而我这种小学渣每次都在及格边缘反复横踩。所以，我想用这个账号记录我的科研日常，希望能和大家一起学习。之前的几篇笔记中，我分享过引物设计、载体酶切、同源重组等非常具体的实验方法。但最近我发现，很多粉丝朋友们刚开启自己的科研之旅，或者是偏向临床的科研大佬们，对分子克隆实验整体了解比较少。所以今天，我想跟大家分享一下质粒构建的大体流程。明确你的目标 𐟎斥…ˆ，在构建质粒之前，你需要有一个清晰的计划。明确你要使用哪种克隆方法，比如同源重组、TOPO克隆还是T4连接。TOPO/TA克隆不需要同源臂，而同源重组和T4连接是需要同源臂的。选择合适的载体 𐟚€ 根据你的实验目的，选择合适的表达载体。例如，常用的原核表达载体有pET28a，真核表达载体有pcDNA3.1，CRISPR/Cas9表达载体有Lenti-V2等等。载体可以通过酶切或者环形PCR后，跑胶回收所需的载体片段。设计引物并扩增片段 𐟔슦 𙦍€选的构建方法，设计并合成引物。PCR扩增需要插入的目的片段，PCR的产物也需要通过跑胶回收。连接与转化 𐟔„ 将载体和目的片段连接后，转入合适的感受态细胞内。例如，DH5˜“产生突变或者缺失，而Stable3相对更加稳定。但提质粒时需要使用试剂盒中的去蛋白液洗3遍，以充分去除核酸酶，减少后续对质粒酶切等实验的影响。通常连接产物的用量不超过总体积的1/20。然后在冰上静止20分钟，热激1分钟，再冰上静置3分钟，加入无抗的LB培养基，摇床摇40-60分钟，最后涂在合适抗性的LB平板上。培养与鉴定 𐟧ꊌB板子放在37度培养箱内过夜生长，第二天挑取单克隆细胞，置于合适抗性的LB培养基中摇菌，然后提质粒送测序公司测序。如果你想偷懒的话，也可以直接送菌液到公司哦，菌液和质粒的测序价格是一样的。今天就分享到这啦，希望这些内容对大家有用！如果有什么问题或者要补充的，欢迎评论或者私信哦！𐟘Š

分子生物学小技巧：质粒提取全解析 𐟧슨𔨧𒒦取是分子生物学实验中的基本操作，但你真的了解其中的原理吗？很多人只知道使用试剂盒中的P1、P2、P3溶液，却对具体成分和作用一知半解。今天，我们就来深入探讨质粒提取的背后原理，让你真正掌握这项技术！质粒提取的基本原理 𐟌 质粒是独立于染色体外能够自我复制的环状DNA分子。质粒提取采用的是强碱裂解法。基本原理是：细菌悬浮液暴露于高PH的强阴离子洗涤剂中，细胞壁被裂解，染色体DNA和蛋白质发生变性，相互缠绕形成大型复合物。然后被十二烷基硫酸盐包裹，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中沉淀下来，离心去除后，质粒DNA就存在于上清液中。由于DNA带负电，而质粒提取柱相当于一个阴离子柱，能够在高盐的条件下吸附DNA，然后通过去离子水洗脱，就得到纯化的质粒DNA了。 P1、P2、P3到底是什么？ 𐟧ꊐ1: 1M Tris-Hcl(PH8.0)25 mL + 0.5 MEDTA(PH8.0) 10mL 加超纯水定容至500mL，温热灭菌，常温保存。用时现加RNase。 P2: NaOH 4g + SDS 5g。加超纯水定容至500mL, 湿热灭菌, 常温保存。 P3: 乙酸钾147.21g + 冰醋酸57.5mL，加超纯水定容至500mL, 湿热灭菌, 常温保存。实验步骤详解 𐟏튥ꌥ‰试剂准备：从培养箱中取出前一天摇的菌液，从中取2mL离心，去上清，备用。P1在使用前加入RNA酶。菌体裂解：根据试剂说明，向含有菌体沉淀的EP管中加150 P1，震荡管底，使菌体全部溶解于溶液1中。然后加入150 P2，温和地上下翻转EP管8-10次。加入500 P3，立即剧烈翻转EP管8-10次，此时EP管中出现白色絮状沉淀。过柱纯化：将EP管12000转离心1分钟，用枪头小心地吸出上清液至收集柱中。12000转离心1分钟，弃去滤液，向收集管中加入500 PW漂洗液，12000转离心1分钟，弃去滤液，重复加入500 PW漂洗液，12000转离心1分钟，弃去滤液,12000转离心2分钟。把收集柱装入新的EP管中，室温晾干5分钟。在收集柱的膜中加入50提前预热的EB buffer或去离子水。室温静置1分钟。12000转离心2分钟。得到质粒DNA溶液。常见问题解答 𐟛 ️ 质粒提取的得率低或无质粒：可能是菌体老化或质粒拷贝数低。可以重新涂布筛选，挑选新的菌落进行液体培养。碱裂解不充分：收集的菌体含量较高时，可以酌情提高溶液P1、P2、P3的含量。乙醇残留：漂洗液没有去除干净。可以两遍醇洗以保证盐离子完全清除。洗脱处理不当：洗脱液加入较多或者洗脱时间过短。可以提前将洗脱液加热，从而加速DNA从柱体的脱离。质粒的纯化不足：可能混有RNA或基因组DNA。可以避免加入溶液P2、P3时剧烈震荡，减少菌体用量。总结 𐟓 看完这篇，你是不是对质粒提取的原理有了更深入的了解？下一期，我们将继续探讨大提质粒的技术。记得关注哦！

质粒提取常见问题解答𐟌€𐟌€ 在质粒提取过程中，我们可能会遇到各种问题。以下是一些常见问题的解答：如何确定质粒小抽的细胞用量？⬇️ 在一般的载体构建实验中，几微克的DNA就足够了。因此，小提5ml菌液通常能满足需求。如果使用过多的细胞，由于试剂盒的限制，可能会导致菌液难以裂解，而且DNA的纯度和得率也不会显著提高。对于需要大量质粒的情况，可以考虑更换提取试剂盒或按比例增加各溶液的用量。电泳分析抽提的质粒会看到什么？𐟌Š 如果质粒的纯度很差，电泳加样孔往下看到的条带依次是基因组DNA、开环环状质粒、超螺旋质粒、变性的超螺旋质粒和细菌RNA。高质量的质粒胶图主要部分为超螺旋质粒，没有RNA等污染。质粒制备的得率由哪些因素决定？𐟌𑊨𔨧𒒧š„得率受多种因素影响，包括宿主细胞类型、大肠杆菌的数量、质粒的拷贝数和提取过程中使用的纯化方式（试剂盒类型）。质粒需要什么样的纯度？𐟔 对于一般的载体构建和测序检测，手工和试剂盒制备的DNA就能达到要求。但如果质粒用于细胞转染实验，则需要无热源、无内毒素的质粒。为什么酶切鉴定“有插入片段”的质粒测序却发现是空的？✂️ 主要原因是在提取质粒的过程中产生了变性的超螺旋质粒，限制性内切酶无法对其进行酶切。因此在判断酶切效果时，变性的超螺旋质粒常被误认为是酶切下来的片段，从而导致误判。可以通过在酶切后的电泳分析中增加一个原始质粒进行对照来避免误判。如何判定DNA的纯度和浓度？𐟓 使用试剂盒抽提的质粒DNA，可以通过仪器检测OD260和OD280浓度，通常OD260/OD280的比值在1.7-1.8之间。1 OD260=50/ml。如果要估算质粒浓度，建议通过琼脂糖电泳来判断会更准确一些。为什么有些纯化的质粒时间长了会发生降解？⏳ 主要原因可能是核酸酶的污染。除了在质粒提取过程中带入核酸酶外，质粒宿主细胞的种类也会影响到抽提质粒的质量。如果提取的质粒需要长期保存，可以使用内含丰富核酸酶活性的大肠杆菌，如DH5€DH1等。

- 构建表达载体是分子生物学实验中的重要一步，以下是详细的步骤和注意事项：第一步：克隆目的基因 𐟧슩斥…ˆ，你需要克隆目的基因。虽然PCR反应看起来很简单，但很多人都会在这一步遇到问题。你的模板可能是质粒、cDNA或基因组DNA。PCR的结果取决于你使用的每个成分。首先，确保使用高保真酶，这样可以获得保真性强的基因。其次，引物设计要足够特异，长度可以稍长一些，建议一次设计多对引物，因为不一定一次就能成功。第二步：PCR体系与纯化 𐟧𜊥𛺨…ˆ用50的PCR体系，使用大孔胶跑条带并切胶回收。你的目的基因条带必须单一且长度正确，然后进行切胶纯化。不要嫌麻烦，因为这会影响后续连接到克隆载体的步骤。纯化后，别忘了测一下浓度，虽然浓度会比原先低，但问题不大。第三步：连接到克隆载体 𐟔— 将目的基因连接到克隆载体上是很重要的一步。每个实验室使用的克隆试剂盒可能不同，有的用T载，有的用B.zero。按照说明书操作即可。这一步必不可少，因为你的目的基因还没有经过测序，不能直接连接到表达载体上。克隆载体一般使用通用引物，操作方便。很多同学为了省事，直接将目的基因连接到表达载体上，这样后续可能会出现问题。第四步：转化大肠杆菌 𐟦 转化大肠杆菌是一个常规操作。市面上有很多品牌的大肠杆菌感受态细胞。使用时必须严格按照说明书操作，避免反复冻融。刚刚好融化时加入载体转化效率最高。第五步：筛选阳性克隆 𐟔 筛选阳性克隆是常规操作，具体步骤不再赘述。第六步：测序验证 𐟓Š 将提取的质粒进行PCR并送去测序，看看是否与你的目的基因相符。即使长度一致，也不一定是你想要的基因。第七步：连接到表达载体 𐟚€ 最后一步是将目的基因从克隆载体上PCR下来，连接到表达载体上。表达载体的种类很多，取决于你想转化的宿主细胞类型，有真核的、原核的、植物的、酵母的等。设计的引物和使用的连接方法有直接关系。最简便的方法是同源重组。如果使用同源重组方法，用同源臂引物PCR克隆载体。表达载体需要提前进行酶切线性化，推荐双酶切线性化，这样连接效率会更高。按照说明书操作即可，后续的转化大肠杆菌等步骤与之前相同。希望这些步骤能帮助你顺利构建表达载体！如果有任何问题，欢迎留言讨论，大家一起进步！

手把手教学｜质粒转化操作步骤及经验分享

𐟌Ÿ双荧光素酶报告系统必备资源库𐟌Ÿ 在双荧光素酶报告系统的研究中，以下四个资源库网站是科研人员的好帮手，赶紧收藏吧！ Promega 𐟏𗯸：这家公司提供多种荧光素酶底物和试剂盒，满足双荧光素酶报告实验的各种需求。 Addgene 𐟏𗯸：这是一个非营利性的生物资源库，提供质粒和表达载体，包括荧光素酶相关的质粒，方便研究人员进行基因转染和表达。 NCBI 𐟏𗯸：美国国家生物技术信息中心提供了多个数据库，如PubMed、GenBank、Gene等，可以搜索和获取与双荧光素酶报告系统相关的文献、基因序列和蛋白质信息。 PubChem 𐟏𗯸：这是NCBI的化学物质数据库，提供大量的化合物信息和生物活性数据，有助于荧光素酶底物的筛选和选择。这些资源库网站在双荧光素酶报告实验中发挥着重要作用，大家在平时的实验中是否都使用过呢？如果需要更多帮助，可以考虑使用这些资源库网站哦！

𐟧셮transter-E电转实验指南 𐟔쥜腮transter-E电转实验中，对质粒和DNA有着特定的要求哦！ 1️⃣ 对于DNA，含量不宜过高，建议控制在5ug/ml以内，以避免细胞毒性。𐟧ꊊ2️⃣ 质粒DNA必须是高纯度、无菌、无内毒素和无污染的，最好通过氯化铯梯度或阴离子交换进行纯化。⚕️ 3️⃣ 避免使用miniprep试剂盒制备的DNA，因其可能含有高水平的内毒素。𐟚늊4️⃣ 乙醇沉淀法纯化的DNA不适合用于电转染实验，因为其高残留盐会改变电流，对电穿孔有害。𐟙…‍♂️ 5️⃣ 实验前，务必验证质粒DNA的表达体系是否正确，否则电转染效率可能会很低哦！𐟔 遵循这些指南，你的Entranster-E电转实验一定会更加成功！𐟌Ÿ

𐟧쨴觲’转化操作全攻略𐟒‰ 𐟔쥮ž验步骤大揭秘： 1️⃣ 将感受态细胞放置在冰盒上解冻，同时准备好质粒和EP管。 2️⃣ 解冻后，取50感受态细胞加入EP管，再加入0.5-1质粒，冰浴30分钟。 3️⃣ 水浴锅42℃热激60秒，继续冰浴5分钟。 4️⃣ 在超净台内加入500无抗性LB液体培养基，摇床37℃、180rpm孵育15-30分钟。 5️⃣ 离心后去上清，剩余部分轻轻混匀。 6️⃣ 涂板，标记好平板后，取10-20液体涂板，倒置37℃培养过夜。 7️⃣ 第二天观察菌落，合格后封存于4℃。 8️⃣ 挑取单克隆菌落，放入氨苄抗性LB液体培养基中，摇床培养过夜。 9️⃣ 使用试剂盒抽质粒，根据说明书操作。 𐟌Ÿ经验分享时刻： - 感受态细胞-80℃保存，转化前冰上融化。 - 摇床孵育时间根据质粒情况调整。 - 培养基抗生素选择需仔细阅读说明书。 - 涂板量可自行调整，普通质粒可取30涂6cm平板。 - 培养时间一般过夜即可，菌落大小适中时挑菌。 - 提质粒前测OD600值估算细菌浓度。 - 转化前务必阅读质粒说明书，选择合适感受态细胞。 𐟒ᥰ贴士：实验过程中注意无菌操作，确保实验结果准确可靠哦！

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