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克隆载体最新视觉报道_克隆人有生殖能力吗(2024年12月全程跟踪)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：热点更新日期：2024-12-01

克隆载体

分子生物学入门：载体的世界在Cohen和Boyer的实验中，我们见证了两种质粒在E. coli中的复制能力。这两种质粒都扮演着载体的角色，使得重组DNA得以复制。所有的基因克隆实验都需要这样的载体，我们称之为载体（Vector）。典型的基因克隆实验只涉及一个载体，以及一个依赖于载体进行复制的外源DNA片段。外源DNA没有复制起点，即DNA复制开始的地方，因此除非将其放入具有复制起点的载体中，否则它无法复制。自20世纪70年代中期以来，科学家们已经开发了许多不同类型的载体，主要分为两大类：质粒（plasmid）和噬菌体（phage）。无论载体的性质如何，都必须通过转化将重组DNA引入细菌细胞。传统的做法是将细胞在浓缩的钙盐溶液中孵育，使细胞膜变得通透，然后将这些通透的细胞与DNA混合，以使DNA进入细胞。或者，人们可以使用高电压将DNA压入细胞，这个过程称为电转化（electroperation）。在克隆时代的早期，Boyer和他的同事们开发了一系列非常受欢迎的载体，称为pBR质粒系列。如今，除了pBR质粒之外，人们还可以选择许多其他的质粒克隆载体。一个有用，但稍显过时的质粒系列是pUC系列。这些质粒基于pBR322开发的，其大约40%的DNA已被删除。此外，pUC载体具有许多限制酶切割位点，这些位点集中在一个称为多克隆位点（MCS）的小区域内。pUC载体含有一个氨苄青霉素抗性基因，以允许选择接收质粒拷贝的细菌。此外，它们具有在筛选含有重组DNA的克隆时提供便利的遗传元件。 pUC载体的多克隆位点位于编码半乳糖苷酶氨基末端部分（肽）的DNA序列（称为lacZ'）内。与pUC载体一起使用的宿主细菌携带编码半乳糖苷酶羧基末端部分（肽）的基因片段。仅凭这些部分基因产生的半乳糖苷酶片段没有活性。但它们可以在体内通过所谓的互补来互补。换句话说，这两个部分基因产物可以结合形成具有活性的半乳糖苷酶。因此，当pUC18自身转化携带部分半乳糖苷酶基因的细菌细胞时，会产生活性半乳糖苷酶。如果将这些克隆接种在含有半乳糖苷酶指示剂的培养基上，含有pUC质粒的菌落将变色。例如，指示剂X-gal是一种合成、无色的半乳糖苷；当半乳糖苷酶分解X-gal时，它会释放出半乳糖和一种可以将细菌菌落染成蓝色的靛蓝染料。另一方面，通过将一个插入片段放入多克隆位点可用。

如何选择和构建质粒载体？一文搞定！在分子克隆的世界里，选择合适的质粒载体可是个技术活儿。今天，我们就来聊聊如何挑选和构建质粒载体，让你的实验更上一层楼！质粒载体的构成要素 𐟧슩斥…ˆ，咱们得搞清楚质粒载体的构成。简单来说，质粒载体就像是基因工程的“运载工具”，负责把外源基因送到受体细胞里。它们是一类能自我复制的DNA分子，其中有一段DNA可以被切除而不影响复制，这样就可以用来置换或插入外源基因。常见的质粒载体有质粒、噬菌体和病毒等，但今天我们主要聊聊质粒。质粒载体通常具备以下几个要素：复制起始位点（Ori）：控制复制的起点。抗生素抗性基因：方便检测。多克隆位点（MCS）：用于插入外源基因片段。启动子/增强子：调节基因表达。终止信号：确保基因表达正确。 poly(A)稳定mRNA：增加mRNA稳定性。如何选择质粒载体？ 𐟤” 选择质粒载体时，主要考虑以下几个方面：构建目的：是要克隆还是表达？选择合适的克隆载体或表达载体。载体类型：克隆载体：根据克隆片段大小选择，小的选质粒，大的选其他类型。表达载体：根据受体细胞类型选择，比如原核或真核。启动子：选择合适的启动子，特别是对于真核蛋白质表达时要注意稀有密码子、糖基化修饰和阅读框错位等问题。酶切位点：载体MCS中的酶切位点数和组成方向要适应目的基因与载体的连接，避免阅读框架错位。选择质粒载体的4点要求 𐟌Ÿ 尽量选分子量小的质粒：小载体（1-1.5kb）更稳定，不易损坏，拷贝数也多。使用松弛型控制质粒：可自主复制，每个宿主细胞有10~200个质粒拷贝，有利于分子克隆。具备多种限制性内切酶切点：但每种切口最好只有1个。必须有易检测的标记：如抗药性标记，蓝白斑试验等。小结 𐟓 无论你选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。希望这些小贴士能帮你在分子克隆的道路上走得更稳、更远！

𐟧쨴觲’载体构建全攻略✨ 𐟔 你是否对质粒载体构建感到困惑？别担心，这篇攻略将带你一步步了解整个流程！ 𐟒ᠪ*质粒载体设计** * **优化序列**：通过突变或重组技术，提升质粒在宿主细胞中的复制效率和稳定性。 * **添加元件**：为质粒添加启动子、终止子等，增强其功能和表达效率。 * **多克隆位点**：设计并插入多克隆位点，提供多个独特的酶切位点，方便插入外源基因。 * **高拷贝数质粒**：改造质粒以增加其在宿主细胞中的拷贝数，提高外源基因的表达量。 𐟔젪*质粒载体类型** * **克隆载体**：按用途分类，包括原核载体、真核表达载体等。 * **表达调控载体**：体外转录载体、基因表达载体等，用于实现基因的表达调控。 𐟛𐯸 **重组蛋白表达载体** * **特点**：含有目标蛋白筛选、纯化的特定标签元件。 * **限制**：成本高，放大困难，部分蛋白因结构复杂而无法高效表达。 𐟒‰ **非编码RNA表达载体** * **特点**：调控基因表达，引发免疫反应。 * **应用**：研究非编码RNA生物学功能，治疗某些由异常基因表达引起的疾病。 𐟔꠪*CRISPR Cas9敲除载体** * **特点**：基于CRISPR-Cas9系统的基因敲除工具，具有高度的RNA识别和切割能力。 * **应用**：编辑对象包括DNA和RNA，广泛应用于各种生物体系。 𐟒ᠪ*常见问题及解决方案** * **重组效率低**：优化酶切、连接条件，或尝试使用不同的连接酶。 * **外源基因片段丢失**：检查酶切位点是否正确，避免使用非特异性酶切。 * **重组质粒不稳定**：在质粒载体上加入稳定序列，如复制原点、选择标记等。 ✨ 现在，你是否对质粒载体构建有了更清晰的了解呢？赶快行动起来吧！

如何阅读质粒图谱：简单五步搞定！ 𐟧ꧬ줸€步：首先找到 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核、真核或穿梭质粒）。 𐟧ꧬ줺Œ步：接着看筛选标记，例如抗性标记，决定使用哪种筛选标记。例如： Ampr：水解𜍥†…酰胺环，解除氨苄的毒性。 tetr：阻止四环素进入细胞。 camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活。 hygr：使潮霉素䱦𔻣€‚ 𐟧ꧬ줸‰步：查看多克隆位点（MCS），它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 𐟧ꧬ쥛›步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 𐟧ꧬ줺”步：检查是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。启动子：促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。增强子/沉默子：为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。

质粒图谱详解：四大要素及常见元件在生物科研领域，质粒是一个常见且重要的概念。当你面对质粒图谱时，可能会被各种箭头和英文序列搞得一头雾水。别担心，今天我就来为你详细解读质粒图谱的四大要素和一些常见的元件。复制起点：质粒的“心脏” 𐟒“ 首先，我们来说说复制起点。质粒的复制起点决定了质粒的宿主和拷贝数。图谱中的ori就是复制起点的标志。如果图谱上只有一个ori，那这个质粒通常是原核克隆和表达质粒。而如果图谱上有两个ori，那这个质粒就是穿梭质粒，可以在原核和真核细胞中复制。筛选标记：质粒的“身份证” 𐟆” 接下来是筛选标记。图谱中的AmpR、KanR等表示抗生素抗性基因，这些基因方便我们通过抗生素筛选阳性克隆。一般来说，只存在单抗性的质粒多是原核克隆载体和原核表达载体，而存在两种或以上抗性的多为穿梭质粒。多克隆位点：外源基因的“入口” 𐟚ꊥ䚥…‹隆位点是多外源DNA的插入位点，通常位于转录启动和转录终止信号之间。图谱中的MCS区或者许多内切酶集中的部分就是多克隆位点。通过酶切后连接的方式，我们可以将外源DNA插入质粒。其他元件：质粒的“配件” 𐟛 ️ 除了复制起始位点、筛选标记和多克隆位点外，质粒载体中还有一些其他的表达或调控元件，如转录调控元件、翻译调控元件和融合表达标签蛋白等。这些元件可以增强质粒的功能性，比如蛋白纯化标签蛋白（如His-Tag、GST-tag）、蛋白检测标签蛋白（如Myc-Tag、Flag-Tag、HA-Tag）以及荧光蛋白表达标签（如GFP、mCherry）。希望这篇文章能帮你更好地理解质粒图谱，赶紧找个质粒图谱去看看吧！相信你会有更多的收获！

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𐟧쥦‚何轻松解读质粒载体图谱𐟓– 𐟔解读质粒载体图谱是生物实验的关键步骤，它让你更深入了解质粒的结构与功能。下面，让我们一起探索如何轻松解读这个复杂的图谱吧！ 𐟓Œ首先，找到关键元素： 1️⃣ 复制起始位点（Ori）𐟔„，它是质粒复制的起点，通常只有一个。 2️⃣ 抗生素抗性基因𐟒Š，如Amp^r或Kan^r，用于筛选转化成功的细胞。 3️⃣ 多克隆位点（MCS）𐟔—，这里可以插入外源基因片段。 4️⃣ 启动子/增强子（P/E）𐟚€，它们控制基因表达，位于基因上游。 5️⃣ 终止信号（Terms）𐟛‘，指示转录结束的位置。 𐟔接下来，分析载体类型： * 原核载体通常含有原核生物的复制起始位点。 * 真核载体则含有真核生物的复制起始位点。 * 穿梭载体两者都有，能在两种生物间复制。 𐟤”然后，考虑载体的应用： * 如果是克隆基因，选克隆载体。 * 如果是表达基因，选表达载体。 * 别忘了考虑稳定性、复制效率和转化效率哦！ 𐟔ꥈ륿˜了检查限制酶切位点： * 在插入外源基因前，要确保载体上的限制酶切位点与目标基因相匹配。 𐟓还有，注意载体大小： * 质粒通常只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。 𐟎‰最后，确认表达系统元件： * 如果载体是表达型，应包含启动子、核糖体结合位点等，驱动外源基因表达。现在，你是不是对质粒载体图谱有了更深入的了解呢？𐟎‰

𐟧쨴觲’载体构建的三大方法𐟔슦‹🥈𐧛„基因后，如何高效地将其克隆到质粒载体上呢？这里介绍三种主流的载体克隆方法： 1️⃣ T4连接酶法𐟔—：首先，使用相同的限制性内切酶同时双酶切质粒载体和目的片段，使两端产生黏性末端。然后，利用T4连接酶进行连接。注意保护酶切后的黏性末端，避免破坏。 2️⃣ 无缝克隆法（同源重组）𐟧쯼š 这种方法需要线性化载体与目的片段带有20bp左右的同源臂。通过5’端核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的共同作用，实现载体的无缝克隆。优点是连接效率高，且阳性率高。 3️⃣ PCR法克隆载体𐟒‰：最经典的是环PCR对质粒进行点突变，可以删除或添加序列到载体上。CR还能连接长片段到载体上，完全脱离了酶切位点的限制。这三种方法各有特点，选择哪种取决于你的具体需求和实验条件哦！𐟧ꀀ

三分钟搞懂T4法构建载体的三种变式连接今天我们来聊聊T4法在构建载体时的三种变式连接。T4法常用于空载体的改造，通过两种内切酶将质粒DNA切开，产生带有黏性末端的线性化载体。目的片段通常是合成的小片段DNA分子，长度通常在100bp以下。首先，我们来说说环PCR。环PCR的点突变一般只能引入60bp以下的序列。具体来说，60bp中，20bp作为扩增序列，40bp是额外添加的5’端附加序列，其中需要包含一段同源臂，真正能引入的大概只有40-45bp的额外序列。很少看到有人把PCR使用的引物设计到60bp以上。接下来是无缝克隆。无缝克隆在载体骨架上引入100bp左右的小片段更是一种灾难。无缝克隆酶主要包含三种核心功能酶：5’端核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶。其中5’端核酸外切酶的功能远比大家想象的更加强大。虽然我们讲同源臂加20bp左右的序列，但其实5’端核酸外切酶远不止切割掉这20bp左右的同源臂，个人认为切割长度起码在60bp以上。左右各切60bp的话，我们合成的100bp的DNA分子其实已经被切碎了，自然不可能连接到载体上。所以，我们只能通过T4法将80-150bp的短小DNA序列插入载体骨架。具体设计方式如上图所示。下一期，我们将探讨一种被称为“玄学”的技术——搭桥PCR或重叠PCR。这是我以前做分子克隆时第一个感觉玄学的实验，当然到现在我自认为已经非常精通其原理，但仍感觉其相当玄学。关注我，我们一起领略科研背后的底层逻辑！

分子克隆实验指南：从零开始到成功大家好！首先，非常感谢你们的关注和喜欢，真的很开心我的笔记能帮到大家。还记得最开始的那篇笔记，记录了我那次离谱的分子克隆实验，4个片段的同源重组竟然花了两个月！后来我慢慢发现，分子克隆其实非常微妙，有点像高中时的数学，学霸们轻而易举考100分，而我这种小学渣每次都在及格边缘反复横踩。所以，我想用这个账号记录我的科研日常，希望能和大家一起学习。之前的几篇笔记中，我分享过引物设计、载体酶切、同源重组等非常具体的实验方法。但最近我发现，很多粉丝朋友们刚开启自己的科研之旅，或者是偏向临床的科研大佬们，对分子克隆实验整体了解比较少。所以今天，我想跟大家分享一下质粒构建的大体流程。明确你的目标 𐟎斥…ˆ，在构建质粒之前，你需要有一个清晰的计划。明确你要使用哪种克隆方法，比如同源重组、TOPO克隆还是T4连接。TOPO/TA克隆不需要同源臂，而同源重组和T4连接是需要同源臂的。选择合适的载体 𐟚€ 根据你的实验目的，选择合适的表达载体。例如，常用的原核表达载体有pET28a，真核表达载体有pcDNA3.1，CRISPR/Cas9表达载体有Lenti-V2等等。载体可以通过酶切或者环形PCR后，跑胶回收所需的载体片段。设计引物并扩增片段 𐟔슦 𙦍€选的构建方法，设计并合成引物。PCR扩增需要插入的目的片段，PCR的产物也需要通过跑胶回收。连接与转化 𐟔„ 将载体和目的片段连接后，转入合适的感受态细胞内。例如，DH5˜“产生突变或者缺失，而Stable3相对更加稳定。但提质粒时需要使用试剂盒中的去蛋白液洗3遍，以充分去除核酸酶，减少后续对质粒酶切等实验的影响。通常连接产物的用量不超过总体积的1/20。然后在冰上静止20分钟，热激1分钟，再冰上静置3分钟，加入无抗的LB培养基，摇床摇40-60分钟，最后涂在合适抗性的LB平板上。培养与鉴定 𐟧ꊌB板子放在37度培养箱内过夜生长，第二天挑取单克隆细胞，置于合适抗性的LB培养基中摇菌，然后提质粒送测序公司测序。如果你想偷懒的话，也可以直接送菌液到公司哦，菌液和质粒的测序价格是一样的。今天就分享到这啦，希望这些内容对大家有用！如果有什么问题或者要补充的，欢迎评论或者私信哦！𐟘Š