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克隆形成实验权威发布_克隆形成实验原理及步骤(2024年12月精准访谈)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：观点更新日期：2024-12-02

克隆形成实验

细胞克隆形成实验：详细步骤与成图方法细胞克隆形成实验是一种常用的细胞生物学研究方法，通过这种方法可以研究细胞的增殖和分化。以下是详细的实验步骤和注意事项：细胞准备 𐟧ꊩ斥…ˆ，选择处于对数生长期的细胞，这个时候细胞增殖活跃，非常适合进行克隆形成实验。使用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，将细胞完全悬浮于完全培养基中，并进行准确计数。细胞接种 𐟌𑊥𐆧𛆨ƒž悬液进行梯度倍数稀释，根据实验需要控制每孔的细胞数量，通常在400-1000个细胞/孔之间。将稀释后的细胞悬液接种于6孔板或其他培养板中，每个实验组设3个复孔以提高实验的准确性。注意稀释细胞可采取梯度稀释法，铺板后在显微镜下观察细胞数量和状态，如是否是单克隆，数量是否适宜。数量过多导致克隆会连成一片，数量过少可能会导致克隆无法正常生长。培养 𐟌🊥𐆦Ž姧好的细胞培养板置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。培养时间根据细胞类型和生长速度而定，通常需要10-14天或直到大多数单个克隆中的细胞数超过50个细胞，克隆的大小通常在0.3到1.0毫米之间。固定与染色 𐟎芥𝓥…‹隆形成后，使用4%多聚甲醛或甲醇固定细胞，固定时间根据实验条件而定，通常为15-30分钟。弃去固定液，用PBS洗涤细胞。使用结晶紫（0.1%-0.5%浓度）或其他染色剂对细胞进行染色，染色时间控制在5min-20min内。染色后用PBS清洗多余的结晶紫染料，将细胞克隆晾干。观察与计数 𐟔 使用倒置显微镜观察细胞克隆的形成情况，并进行拍照记录。对克隆进行计数，计算克隆形成率：克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)㗱00%。通过以上步骤，你可以得到细胞的克隆形成情况，进一步研究细胞的增殖和分化机制。

细胞克隆形成实验详细步骤，轻松上手！集落克隆形成实验是测定细胞存活率和考察单个细胞增殖能力的重要方法。常用的方法有两种：平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。以下是详细的实验步骤和注意事项，帮助你轻松上手。 𐟧ꠥꌨ‰‚： 0.25%胰酶溶液含10%胎牛血清的培养基 PBS溶液结晶紫染色液超纯水 𐟔 染液配方： 1%结晶紫染色液：称取1克结晶紫粉末，加入20毫升甲醇，80毫升DW水溶解，常温保存。 0.4%结晶紫染色液：称取0.4克结晶紫粉末，用100毫升甲醇溶解，常温保存。 𐟓 实验步骤（以6孔板为例）： 1️⃣ 制备细胞悬液：将对数生长期的单层细胞进行常规消化离心，收集细胞沉淀。重悬细胞沉淀，计数，可倍比稀释至15000个/毫升。 2️⃣ 接种细胞：取20微升，300个细胞接种六孔板中（根据细胞生长情况确定），补加3毫升培液，置于培养箱中培养2-3周。如果要加药处理的话，等到第二天贴壁即可加药。 ⚠️ 注意事项：计数要准确，最好计3遍，取平均值。接种细胞时，一定要把细胞晃匀。培养过程中要注意培养液的颜色，必要时中间可更换培液，注意观察是否有污染。 3️⃣ 染色：当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，停止培养，弃掉培液，用4℃预冷的PBS小心洗涤2-3次，弃掉PBS。每孔加入1毫升0.1%结晶紫染色5分钟，流水缓缓洗去染液，自然室内干燥。 ⚠️ 注意事项：在培养过程中，可以隔两三天在显微镜下观察一下，如果大多数克隆均含有50个以上的细胞，这时就可以终止培养了。 4️⃣ 计数：镜下计数含50个细胞以上的克隆数并拍照，取3个复孔的克隆平均值进行计算：克隆形成率＝平均克隆数/接种的单个细胞数㗱00%。通过以上步骤，你就能轻松完成集落克隆形成实验，了解细胞的增殖能力啦！𐟒ꀀ

细胞克隆形成实验：平板与软琼脂方法详解细胞的克隆形成实验主要分为两种：平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。这两种方法适用于不同类型的细胞，具体步骤和注意事项也有所不同。平板克隆形成实验 𐟓– 适用对象：主要用于贴壁生长的细胞。制备细胞悬液：将对数生长期的单层细胞用胰蛋白酶消化，并吹打成单个细胞，悬浮在完全培养基中备用。接种细胞：将细胞悬液以适当的密度接种于培养皿中，一般每孔接种50-1000个细胞（根据细胞生长情况确定）。培养：将培养皿置于37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养10-14天，中途需定期换液并观察细胞状态。染色与计数：当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。用PBS洗涤后，加入固定液和染色液进行固定和染色。最后，在显微镜下计数克隆数并计算克隆形成率。软琼脂克隆形成实验 𐟌€ 适用对象：主要用于悬浮生长的细胞，特别是某些恶性肿瘤细胞。制备琼脂和细胞悬液：分别制备1.2%和0.7%的低熔点琼脂糖溶液，高压灭菌后维持在40℃左右防止凝固。将对数生长期的单层细胞消化并吹打成单个细胞，悬浮在完全培养基中备用。铺下层胶：将1.2%的琼脂糖与2㗥…襟𙥅𛥟𚦷𗥐ˆ后铺入培养皿中，冷却凝固后作为底层琼脂。接种细胞：将0.7%的琼脂糖与细胞悬液混合后铺入已铺有底层琼脂的培养皿中，形成双琼脂层。最后铺上一层培养基以防止胶干燥并给细胞补充营养。培养与观察：将培养皿置于培养箱中培养2-3周。定期观察克隆形成情况，并在显微镜下计数克隆数。实验意义 𐟔슦〦𕋧𛆨ƒž增殖能力：通过克隆形成实验可以评估细胞的增殖潜力和群体依赖性。评价药物敏感性：可用于验证肿瘤细胞对药物、放疗等在增殖能力方面的敏感性。评价体内成瘤性：虽然肿瘤细胞不一定都能在体内成瘤，但体外克隆形成能力越强，通常表明体内成瘤性越强。因此，克隆形成实验可作为判断体内成瘤的模拟指标。注意事项 ⚠️ 实验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞必须分散成单个细胞悬液，接种密度不能过大以避免细胞团的形成。在实验过程中要注意无菌操作以防止污染。染色和固定时要避免局部残留固定液或染剂造成染色不均一。计数克隆时要选择适当的视野和计数标准以确保结果的准确性。通过这些实验方法，我们可以更好地了解细胞的增殖能力和药物敏感性，为后续的实验和临床治疗提供参考。

软琼脂克隆形成实验：步骤详解与注意事项软琼脂克隆形成实验是一种利用软琼脂作为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长的实验方法。这种方法特别适用于某些恶性肿瘤细胞，它们不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖。通过软琼脂中形成克隆的能力，可以反映细胞的恶性程度，适用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验。实验步骤配制琼脂：首先，配制1.2%和0.7%的琼脂，并进行高压灭菌。将灭菌后的琼脂保持在42℃左右，以防其凝固。制备下层胶：将1.2%的琼脂与2㗥Ÿ𙥅𛥟𚦷𗥐ˆ，铺入6孔板中，每孔1.5ml。在37℃下孵育30分钟，使其凝固。制备上层胶：将制备好的单细胞悬液与0.7%的琼脂充分混匀，加入6孔板中，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次。观察克隆：根据细胞的生长速度，培养2~3周后，在显微镜下观察克隆的大小。每个克隆应包含超过50个细胞。若需要拍照，可以加入200的氯化硝基四氮唑蓝（NBT）进行染色，37℃过夜后拍照。数据分析：通过显微镜或相机拍照，计算克隆形成率。例如，通过软琼脂克隆形成实验检测ME2蛋白对神经胶质瘤细胞生长的影响。在神经胶质瘤细胞GBM8401中将ME2蛋白敲低，形成的克隆数会减少。注意事项上层软琼脂：上层软琼脂使细胞分散成单个，下层软琼脂作为支撑防止细胞贴附生长。最后铺上一层培养基是为了防止胶干燥，并给细胞补充营养。如果需要进行药物处理，则在培养基中加入药物。细胞数目：上层胶中的细胞数目根据不同的细胞类型而定。一般以5000个细胞/孔作为起始浓度，根据需要调整。温度控制：琼脂放入水浴锅中维持在42℃左右。温度过低琼脂会凝固，温度过高则会将细胞烫死。此外，实验过程中速度要快，防止局部结块。选择克隆方式根据实验对象和目的选择不同的克隆方式。平板克隆主要用于检测贴壁肿瘤细胞的增殖能力和致瘤性，而软琼脂克隆形成实验除了检测贴壁细胞，还能检测悬浮肿瘤细胞和转化细胞系，具有平板克隆不可取代的优势。如果只是简单评价贴壁细胞的增殖能力和群体依赖性，选择平板克隆即可。通过这些步骤和注意事项，你可以成功地进行软琼脂克隆形成实验，深入了解细胞的生长和分化机制。

𐟔젧𛆨ƒž实验全攻略：从原理到步骤 𐟓š 细胞克隆形成实验：详细步骤与原理，让你轻松掌握。 𐟓Š qPCR实验：从原理到操作步骤，全面解析。 𐟌ˆ 免疫组织化学：原理和方法，助力你的科研探索。 𐟒ᠥˆ’痕实验：从实验设计到结果分析，一应俱全。 𐟌𑠧𛆨ƒž凋亡检测：流式细胞术的应用，揭示细胞凋亡的奥秘。 𐟓– 分子生物学实验手册：涵盖多种实验技术，提升你的实验技能。 𐟚€ Transwell实验：原理、步骤和注意事项，助你成功开展实验。 𐟌Ÿ 细胞实验技术手册：全面介绍细胞实验的原理和方法，提升你的实验水平。 𐟔젗estern blot实验：从原理到操作步骤，详细解析。

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𐟔젥𙳦🥅‹隆形成实验全攻略：步骤与技巧 𐟓 实验步骤（以6孔板为例） 1️⃣ 制备细胞悬液：将处于对数生长期的单层细胞进行常规消化离心，收集细胞沉淀。重悬细胞沉淀并计数，可倍比稀释至1㗱0ⳤ𘪯mL。 2️⃣ 接种细胞：以每孔50、100、200个细胞的梯度密度接种六孔板中（根据细胞生长情况确定），补加3mL培液，置于培养箱中培养，静置2-3周。若需加药处理，可于第二天贴壁后加药。 - 注意事项：计数要准确，最好计3遍取平均值；接种细胞时要晃匀；培养过程中注意培液颜色，必要时更换培液并观察污染情况。 3️⃣ 染色：当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，停止培养，弃掉培液，用PBS小心洗涤2-3次，弃掉PBS。每孔加入1ml甲醇固定15min，弃固定液。每孔加入1ml 0.1%结晶紫或Giemsa染色液染色10-30min，流水缓缓洗去染液，空气干燥。 - 注意事项：培养过程中可隔两三天在显微镜下观察，若大多数克隆含50个以上细胞，即可终止培养。 4️⃣ 计数：镜下计数含50个细胞以上的克隆数并拍照，取3个复孔的克隆平均值进行计算。实验至少重复2次。 𐟔 常见问题解答细胞密度为多少合适？细胞接种密度与实验结果密切相关。若细胞太多，形成克隆数目太多，难以拍到单独的克隆团；若细胞太少，可能无法形成克隆，影响增殖能力判断。一般来说，正常增殖速度为1:5-1:10传代，3天长满细胞，可以接种500个细胞，其余增殖缓慢细胞，可以接种800-1000。细胞接种后培养的时间如何确定？通常情况下，单个细胞在体外增殖6代以上所组成的细胞群称为一个阳性克隆，时间约为一周；但具体时间因细胞增殖能力而异，因此应密切关注细胞生长情况，隔天在显微镜下观察克隆情况，若单个克隆细胞数到达50个左右即可固定细胞。细胞铺板均匀的重要性若铺板不均匀，细胞稀的地方形成的克隆少，而密的地方克隆多，一方面影响统计结果，并且拍出的图片不美观。细胞未形成克隆的原因？并非每种细胞都可以形成克隆，克隆形成率与细胞本身增殖能力有关。还与接种细胞密度、加入培养液的体积、血清浓度有关。因该实验处理时间较长，应给细胞多加培养基，如每孔4ml，或者3天更换一次培养基，以供给细胞充足的营养。

𐟔젧𛆨ƒž增殖力揭秘：平板克隆实验全解析 𐟌𑠧𛆨ƒž克隆形成实验是生物学研究中的经典方法，它能够直观地反映细胞群体的依赖性和增殖能力。通过这个实验，我们可以了解到细胞在体外环境下的增殖情况，以及各种理化因素对细胞克隆形成能力的影响。 𐟔 实验目的 1️⃣ 评估细胞在处理后的增殖能力，通过克隆形成来观察细胞在培养板上的生长情况。 2️⃣ 探索不同杀伤因素（如药物、基因等）对肿瘤细胞增殖能力或群体依赖性的影响。 3️⃣ 预测细胞在体内的成瘤性，体外克隆能力越强，体内成瘤性越强，为体内实验提供参考。 𐟧ꠥꌨ所需材料：基础培养基（根据细胞类型选择）胎牛血清胰蛋白酶 PBS 青霉素-链霉素溶液（100X）多聚甲醛固定液结晶紫染液 Giemsa染液基本步骤： 1️⃣ 取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中。 2️⃣ 将细胞悬液进行梯度倍数稀释，分别以每皿50、100、200个细胞的密度接种到含10mL预温培养液的皿中，轻轻转动使细胞均匀分布。 3️⃣ 将培养皿放入37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周，经常观察，当出现肉眼可见的克隆时终止培养。 4️⃣ 弃去上清液，用PBS小心浸洗2次，加入4%多聚甲醛固定细胞15分钟。然后去固定液，加入Giemsa染色液染色10～30分钟，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 5️⃣ 将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼或显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数，最后计算克隆形成率。 𐟓Š 数据分析克隆形成率 = (克隆数 / 接种细胞数) 㗠100% 通过这个实验，我们可以深入了解细胞的增殖特性，为后续的实验研究提供有力的数据支持。

平板克隆与软琼脂克隆实验全攻略 𐟓– 平板克隆实验取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，悬浮在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中备用。将细胞悬液进行梯度倍数稀释，以适当的细胞密度（根据增殖能力）接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。将培养皿置于37℃、5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2-3周。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心清洗2次。加纯甲醇5mL，固定15分钟，然后去固定液，加适量0.1%结晶紫染色20-30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。在显微镜（低倍镜）下计数大于10个细胞的克隆数，然后计算克隆形成率。 ⚠️ 注意事项平板克隆形成实验仅适用于贴壁生长的细胞。实验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分布均匀，不能有细胞团，接种密度也不能过大。结晶紫染色后及时拍照并计数克隆，不能在室温放置太久，否则影响拍照效果。缓冲液清洗和固定时沿着孔板侧壁加入，不要吹掉细胞。染色前固定液要吸干净，避免局部残留固定液将染剂稀释造成染色不均一。 𐟓– 软琼脂克隆实验与平板克隆实验类似，但需要在软琼脂中培养细胞。具体步骤包括：制备软琼脂培养基：将琼脂与培养液混合，加热至琼脂完全溶解。接种细胞：将细胞悬液与软琼脂培养基混合，均匀地接种到培养皿中。培养与观察：将培养皿置于37℃、5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养一段时间。经常观察，当出现肉眼可见的克隆时，终止培养。固定与染色：弃去上清液，用PBS清洗后，用甲醇固定并结晶紫染色。计数克隆：在显微镜下计数大于10个细胞的克隆数，计算克隆形成率。 𐟔젥ꌦ𓨦„事项软琼脂克隆实验适用于悬浮生长的细胞。细胞悬液的制备和接种密度同样关键，确保细胞分布均匀。染色和拍照步骤与平板克隆实验相同。通过这些详细的步骤和注意事项，你可以更好地理解和掌握平板克隆和软琼脂克隆实验的技术要点，为细胞实验研究打下坚实的基础。

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