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提质粒最新娱乐体验_质粒图谱大全详解(2024年12月深度解析)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：话题更新日期：2024-12-03

提质粒

高效提取质粒的详细步骤指南𐟧슨𔨧𒒦取的原理：基因组DNA在碱性条件下变性后无法恢复原有构象，而质粒DNA则能在加酸恢复中性后恢复构象。我们利用这一差异来提取质粒。 1️⃣ P1菌体裂解 P1菌体通常保存在-4℃冰箱中。使用含有氢氧化钠（NaOH）和十二烷基硫酸钠（SDS）的混合溶液处理细菌，导致细胞壁和细胞膜破裂，释放出质粒DNA和宿主细胞的基因组DNA。其中还含有RNA酶，可以有效去除RNA。 2️⃣ P2DNA变性在碱性条件下（pH 12.0-12.5），质粒DNA和宿主细胞的染色体DNA都会变性，但质粒DNA由于其较小的分子量和超螺旋结构，变性后仍能保持紧密的缠绕状态。加入P2后要轻轻上下摇晃8-10下，以免过度变性，无法高效提取质粒。 3️⃣ P3/E3DNA复性当加入中和液（如乙酸钾）后，溶液的pH值恢复中性，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，而宿主细胞的染色体DNA复性缓慢，形成大的复合物。此步骤一定要剧烈上下颠倒8-10次，使质粒DNA充分接触中和液，不然提取的质粒浓度会很低。 4️⃣ 离心分离在离心过程中，由于质粒DNA分子较小且复性迅速，它们会留在上清液中；而蛋白质与细菌基因组DNA由于缠绕形成絮状沉淀，在离心时会被沉淀下来。所以此步骤留下的是上清，剩下的就都是去上清啦。 5️⃣ PW 质粒纯化上清液中的质粒DNA可以特异性地吸附到柱子上，通过漂洗将非特异性吸附的杂质洗掉，得到纯化的质粒。 6️⃣ 洗脱液或ddH20洗脱将吸附在柱子上的质粒DNA洗脱下来，得到高纯度的质粒。一般吸取100-200ul即可，最后记得测浓度！第一次使用黄色柱子，第二次使用白色柱子，千万不要弄混，根据说明书使用即可。

中量质粒提取，关键步骤！在分子克隆实验中，质粒的质量至关重要，它直接影响后续实验的效果。今天，我们来探讨如何使用EndoFree Plasmid Midi Kit进行中量提取/制备质粒，并分享一些关键步骤和注意事项。 𐟔 Part I: 准备工作确认P1溶液中已加入RNase，并记得及时放回4度保存。加入buffer P1后，用vortex充分混匀，确保菌块完全裂解。加入buffer P2后，温和混匀，避免打断基因组DNA。加入buffer E3后，立即混匀，防止局部沉淀。 𐟔 Part II: 激活与洗涤使用去内毒素的试剂盒，避免内毒素影响细胞实验。激活柱子，确保Buffer PW中已加入指定体积的100%乙醇。建议用Buffer PW再多洗涤一次，确保质粒纯净。 𐟔 Part III: 洗脱与预热将灭菌蒸馏水提前预热至60度，提高洗脱效率。去除吸附柱中残留的乙醇，以免影响后续酶促反应。建议分两次洗脱，以提高洗脱效率。 𐟑‰ 此外，建议在每一步的间隙为下一步做准备，比如捏管子做标记等，尤其是一天要提几百个质粒的情况。

𐟔쥮ž验室小白成长记：从零开始的科研之旅𐟌𑊰ŸŒŸ 大二那年，我加入了中科大驻我校的实验室，开启了我的科研之旅。实验室的环境和氛围都非常好，导师们都是中科大的，他们还带来了科学岛上的师兄师姐，教我们做实验和传授经验。 𐟧젥ˆš开始加入实验室时，我对很多操作都不熟悉。导师让我跟着一个师姐学习。那一个月，我每天都在问师姐有没有实验可以带我做或者让我观摩学习的。师姐非常耐心地教我各种基础实验操作，比如PCR、菌液制备、易错PCR、跑胶、质粒提取、电转、化转、细菌扩大以及诱导、划线等等。虽然刚开始质粒提取不太熟练，但随着时间的推移，我的操作越来越熟练，提取的浓度也从68ng/提升到了450ng/。 𐟓ˆ 后来，我和学弟分到了一个细胞课题，开始接触细胞学实验。我们学会了各种细胞培养、转染、荧光观察等技巧。每周的组会汇报就像答辩现场一样，导师会提出各种问题，我们则不断道歉并改正。 𐟎‰ 加入实验室后，我发现做实验其实也挺快乐的，感觉自己慢慢在变强。继续加油吧！希望在本科期间能有一篇article发表。

质粒电泳出现多条带？原因及解决方法详解 𐟘𑥜訿›行琼脂糖凝胶电泳时，发现胶上出现的不是单一条带，这可能是由什么原因引起的呢？让我们一起来探讨一下吧！ 𐟔正常情况下，质粒是双链闭合的DNA。但在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度或试剂等因素，质粒DNA链可能会发生断裂。在电泳过程中，这些断裂的质粒DNA可能会形成开环结构，甚至解开螺旋变成线形。因此，大多数质粒提取物中会含有三种构型的质粒。 𐟌€质粒的三种形态： 1️⃣ 线形DNA：两条链都断裂，呈线性分子； 2️⃣ 开环DNA：一条链断裂，呈松弛的环状分子； 3️⃣ 共价闭合环状DNA：两条链没有断裂，呈超螺旋结构。 𐟏Ž️这三种形态在电泳时的分离速度不同，分离率顺序为：超螺旋DNA > 线性DNA > 开环DNA。 𐟒᤺†解这些信息后，如果你在实验中遇到类似问题，就可以更好地理解和解决问题所在啦！

同源重组构建质粒的详细步骤和注意事项 ❤️一、实验步骤 1️⃣ 载体线性化 ❶ 选择合适的克隆位点，对载体进行线性化。推荐使用双酶切方法，以降低转化背景（假阳性克隆）。 ❷ 酶切时，注意酶切时间，确保载体完全线性化。若使用单酶切，可适当延长酶切时间。 2️⃣ PCR扩增插入片段 ❶ 设计带有同源臂的引物，引物5'端引入与线性化载体末端一致的同源序列（15-20 bp）。 ❷ 使用高保真聚合酶进行PCR扩增，确保扩增片段的准确性与特异性。 3️⃣ 重组反应 ❶ 将线性化载体与扩增的插入片段按一定比例混合，加入重组酶，在一定温度下反应一定时间（如37℃，30分钟）。 ❷ 重组反应完成后，可直接进行转化或储存于-20℃备用。 4️⃣ 转化与筛选 ❶ 将重组产物转化至感受态细胞（如DH5𜉯𜌧𛏨🇧ƒ�€、复苏和涂板等步骤，得到单克隆菌落。 ❷ 通过菌落PCR和质粒提取后的酶切鉴定，筛选阳性克隆。 5️⃣ 测序验证 ❶ 将疑似阳性克隆的菌液送测序公司进行双向测序，比对测序结果与设计序列是否一致。 ❷ 若测序结果正确，则表示重组质粒构建成功，可进行后续实验。 ❤️二、注意事项 1️⃣ 引物设计：同源臂的长度和GC含量需控制在合理范围内（15-20 bp，GC含量40%-60%），以提高重组效率。 2️⃣ 酶切与纯化：确保载体线性化完全，并进行彻底的纯化，避免环状质粒残留。 3️⃣ 重组比例：载体与插入片段的摩尔比通常为1:2，根据实际情况调整。 4️⃣ 转化条件：控制转化产物的量和感受态细胞的状态，以获得理想的转化效率。 ❤️三、原理概述同源重组法基于DNA分子间的同源序列，在重组酶的催化下实现载体与插入片段的定向重组。通过设计带有同源臂的引物，扩增出带有同源序列的插入片段，再与线性化的载体进行重组，最终得到重组质粒。 ❤️四、应用实例以RNase P表达载体的构建为例，通过NCBI查找基因序列，设计带有BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点的引物，扩增目的基因片段。随后，将目的基因片段与线性化的pGEX-2T载体进行同源重组，构建成功后转化至BL21工程菌中表达目的蛋白。

哪些实验必须测量DNA浓度？𐟧찟”슥œ觔Ÿ物学和分子生物学研究中，测量DNA浓度是许多实验的关键步骤。你知道哪些实验类型需要测DNA浓度吗？让我们一起来看看吧！ PCR产物的纯化 𐟧슥𝓤𝠥ˆ了一次PCR实验后，通常需要测定扩增产物的浓度，以评估PCR的效率和为后续实验做准备。通常，1个吸光度值（A260）相当于50/ml的双链DNA，或者40/ml的单链DNA或RNA。酶切产物的精确计算 𐟔ꊥœ襈†子克隆实验中，酶切后的DNA片段需要测定浓度，以便进行后续的克隆、测序或其他分析。通过测定A260，你可以得到精确的浓度，为接下来的实验做好准备。质粒提取后的确认 𐟒𞊦取质粒后需要测定其浓度，以确保有足够的质粒用于转化、转染或其他分子生物学应用。基因组DNA提取的质量检查 𐟔 你刚刚从样本中提取了基因组DNA，现在需要评估提取的质量。A260/A280比值大于1.7表示你的DNA纯度很高，没有蛋白质污染。 DNA合成的精确度量 𐟓 你合成了一段DNA，需要知道它的确切浓度。这不仅关系到后续实验的准确性，也关系到你的研究成果的可靠性。构建文库的必备步骤 𐟓š 无论是基因组文库还是cDNA文库，DNA浓度的测定都是构建成功文库的关键。基因组编辑的精细调控 ✂ CRISPR-Cas9等技术需要精确的DNA浓度来优化实验条件，确保基因编辑的成功率。 DNA疫苗的质量控制 𐟒‰ 在开发DNA疫苗时，准确的DNA浓度测定对于确保疫苗的剂量和效果至关重要。这些实验都需要精确的DNA浓度测定，以确保实验的准确性和可靠性。希望这篇文章能帮助你更好地理解DNA浓度测定的重要性！

质粒构建全攻略：从零开始到成功转化 𐟎‰ 看着那些又大又圆的转化子，心情是不是特别美妙？质粒构建其实并不难，只要掌握了基本流程和技巧，你也能轻松搞定！下面我就来详细讲解一下质粒构建的整个过程。质粒构建的基本流程 𐟓œ 首先，我们需要准备好插入片段和载体。插入片段可以是gDNA、cDNA或者已有的质粒，只要上面有你需要的片段就行。然后，用PCR扩增出目标片段，回收这个片段。注意，PCR一般用pfu酶，如果扩增不好可以试试g或者保真较好的Taq。设计引物 𐟔犊设计引物时，需要在引物末端加入合适的酶切位点，这样可以让插入片段和载体进行连接。常见的酶切位点有Sacl、HindIII、EcoRI和KpnI等。你也可以采用同源臂的设计，让载体和插入片段通过同源重组进行连接。去磷酸化处理 𐟌Š 在利用单酶切位点或者同尾酶进行克隆连接时，为了防止载体自身环化，需要对载体进行去磷酸化处理。常用的碱性磷酸酶有Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)或者Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)。去磷酸化反应体系一般包括酶切胶回收后的载体DNA、10xSAP buffer、SAP酶和H2O，总体积20ul。大肠杆菌的转化 𐟦 在实验前，将金属浴或者恒温水箱调至42℃。然后从-80℃冰箱取出感受态细胞，于冰上化冻。接着将连接或者无缝克隆产物全部加入100ul感受态细胞中，用手指轻弹混匀，冰上静置15~20分钟。然后42℃热激90秒，迅速置于冰上2分钟。接着在超净台内向热激后的细菌中加入400-800ul不含抗性的LB培养液，置于恒温摇床内37℃200rpm恢复30~45分钟。离心后倒出大部分LB，留少许约100-150ulLB，在超净台吹匀沉淀菌体，将菌体悬液均匀涂布在含有对应抗性的LB平板上（取决于转化的质粒载体抗性，如Amp*或者Kan*）。将涂布后的平板倒置于37℃恒温培养箱内培养12-16小时。最后挑取6~10个菌落进行菌落PCR鉴定，或者直接进行液体培养，提取质粒后用酶切的方法鉴定阳性克隆。保存阳性菌 𐟧Š 将鉴定出来的阳性菌进行保存，于标记好的冻存管中，每管中加入30%甘油和300新鲜细菌培养液，充分混匀后置于-80℃保存。注意事项：①如果转化的是纯质粒（非连接或者重组产物），一定要降低使用量和感受态细胞使用量、及涂布细菌量。②-80℃保存菌液时，可以在提质粒时留一点备用。希望这篇攻略能帮到你，祝你早日构建出成功的质粒！𐟚€

质粒提取及纯化实验全攻略𐟔슰ŸŒˆ 实验准备 LB培养基：蛋白胨：2g 酵母提取物：1g NaCl：2g 超纯水：200ml 将以上成分加入500ml锥形瓶中，调PH至7.5，封口后120摄氏度灭菌20分钟。灭菌准备：准备两个平板和试管，进行灭菌处理。灭菌后，待培养基冷却，加入200 Amp（氨苄，母液50mg/kg，稀释1000倍）。 𐟓… 操作步骤倒平板： LB培养基（50ml）+1.5%琼脂（0.75g），冷却后加入100 Amp。将培养基倒入50ml离心管中，每个平板约20ml。待平板凝固后，准备5个2ml离心管，每管1ml生理盐水。从-80度冰箱取出大肠杆菌菌液，用1ml枪头刮取菌液，依次稀释。涂布：用酒精灯热灭菌涂布棒，放凉。将平板底部在酒精灯周围烧一下，打开平板，用涂布棒推开菌液，以画圆形式涂布均匀。培养：将平板放入37摄氏度烘箱，倒置培养8小时左右。接菌：用枪吸2ml培养基到试管中，从平板中挑选单菌落，接种到试管中。放入37度震荡培养箱培养8小时，观察是否变浑浊。下午5-6点，浑浊后直接倒入锥形瓶中，37度震荡培养箱培养16-17小时。 𐟔砨𔨧𒒦取及纯化按照生工质粒抽提说明书操作，提取好的质粒去测浓度，并记录在管壁上。 𐟓 注意事项所有操作需在无菌房内进行。灭菌后待培养基冷却再加入Amp。涂布棒使用前需热灭菌并放凉。 𐟔젥ꌧ𛓦Ÿ 实验完成后，确保所有实验器材和物品都已清洁和消毒，以避免交叉污染。

00后实验室新星：师弟的奇遇记实验室来了一位轮转的师弟，名校毕业，生物学背景，性别优越，大家对他充满期待。师弟第一天到实验室，就对实验室的一草一木表现出极大的兴趣，仿佛新生儿第一次看到世界。他对液氮桶结冰的现象感到惊奇，对一个泡沫盒做成的冰盒能仔细端详五分钟，更不用说电泳仪和PCR仪这种大型设备给他带来的震撼。师弟在待人接物上也显得与众不同，对熟悉的师兄师姐直呼姓名，对不熟悉的则以“喂”作为称呼，并趾高气昂地提出自己的要求（例如：有没有剪刀？）。师弟对带自己做实验的师姐表现出一种自己是上帝般的恩赐态度，每天早九晚五，绝不多待一秒钟。师姐以近乎请求的态度说晚上再来一下，师弟义正辞严地拒绝：我晚上要运动，晚上做实验不安全。直到今天，师弟第一次独自提质粒并用电泳验证是否有条带，结果发现质粒没提出来，于是对实验室价值几十万的曝光仪动手动脚表示不满。路过的师姐友好提醒珍惜仪器，师弟终于震怒：你用什么口气跟我说话！然后摘掉手套扔进生活垃圾桶，摔开椅子，一边走路一边跺脚离开实验室。

学校上课的那些幸福时光 𐟎“ 最近帮小师姐处理了五十份发票，提前一天回到学校，感觉整个人都轻松了不少。晚上在万达吃晚饭的时候，突然收到那两口子的消息，瞬间觉得嘴里的香蕉都不香了。可能我还是太笨了吧，没能领悟到让我做阳转还包括提质粒的深意。周一那天，我问了大师姐，她说先挑一两个菌送去测序（记得很清楚，她没提提质粒的事）。当时忙着提那178份RNA，挑完放到摇床就没管了，晚上回学校上课。可能也怀着一种侥幸心理：我走了，后面有啥他俩肯定会安排别人吧？这次算是长教训了，做事得多往后想一步。完美的周四是早上正报发票，被大师兄叫去胶回收测浓度，然后插枪头。大师姐让我洗锥形瓶、配培养基，接着配核酸胶。下午倒平板、报发票，晚上组会。快下班了突然让阳转，十一点才下班。总的来说，我们小组还是非常友爱和谐的，虽然有时候任务重得让人喘不过气来，但大家互相帮助，一起度过难关。在学校上课的日子，真的是既幸福又充实。

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