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tris缓冲液在线播放_20mmtris-hcl缓冲液配制(2024年12月免费观看)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：导读更新日期：2024-12-02

tris缓冲液

𐟔젥ˆ†子生物学实验方法大揭秘 𐟔슰Ÿ“Š 测定用乙醇固定的DNA含量 𐟓Š 1️⃣ 培养细胞的DNA含量测定将细胞制成单细胞悬液，置于200ul的PBS缓冲液中。加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存。 2️⃣ 细胞固定的一般步骤取1~2㗱06个细胞于PBS（PH-7.2）缓冲液中。 300g离心5分钟，弃上清，反复两次。重悬细胞于0.5mlPBS缓冲液中。将细胞悬液放置于2~3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分钟。 3️⃣ 注意事项根据实验要求，固定剂也可选用1~3%多聚甲醛。乙醇作为固定剂时，应预冷至0~4℃。固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团。 𐟓‘ Western Blot(免疫印迹法) 𐟓‘ 主要包括以下4个基本步骤：样品制备电泳分离蛋白的膜转移免疫杂交与显色 𐟧ꠦ𚶦𖲥’Œ试剂 𐟧ꊱX磷酸盐缓冲液(PBS) Modified RIPA buffer 1XSDS样品缓冲液转移缓冲液 10XTris缓冲盐(TBS) TBS/T缓冲液封闭缓冲液(TBS/T) 一抗的稀释 𐟔젦 𗥓制备 𐟔슥ŽŸ始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白。培养细胞或药物处理。弃培养基，用1XPBS漂洗细胞2次。加入1XSDS样品缓冲液，刮落细胞，转移到Ep管。超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。煮沸样品5分钟。离心12000g.5min，取上清。 𐟓Š 电泳分离 𐟓Š 上样15~20ul至SDS-PAGE胶，电泳。 𐟔„ 转膜 𐟔„ 将电泳后的蛋白转移到膜上，进行免疫杂交与显色。 𐟒ᠦ示 𐟒ኤ𘀨ˆ줸Š样20~30ug已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100ug，但电泳条带易拖尾。可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 𐟓ˆ 定量检测蛋白表达水平 𐟓ˆ 用RIPA裂解液裂解细胞，收集裂解液至离心管中。在振荡器上混匀4~15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀。用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度。 𐟔젥ꌦ–𙦳•小结 𐟔슩€š过以上步骤，您可以准确测定用乙醇固定的DNA含量，并进行Western Blot实验，深入探索分子生物学的奥秘。

2023年WB实验全攻略：从原理到操作 𐟔젥ꌥŽŸ理这个实验用到了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，主要是把细胞或组织里的蛋白质分离出来，然后转移到PVDF或者NC膜上。接着，用特定的抗体去和目标蛋白结合，再用辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体进行反应。最后，通过底物显色来分析曝光条带的位置和灰度，从而知道目标蛋白在样本中的表达情况。 𐟓 实验流程样本制备：包括蛋白质提取、定量和变性。 SDS-PAGE凝胶电泳：把蛋白质分离。转膜：通过电转把蛋白质转移到PVDF、硝酸纤维素膜或者尼龙膜上。封闭：用脱脂牛奶或者BSA封闭膜上的非特异性位点。一抗、二抗孵育：让抗体和蛋白质结合。 ECL化学发光检测：显影。胶片灰度分析及数据处理：用内参进行半定量分析。 𐟧ꠦ 𗦜쥈𖥤‡（贴壁细胞总蛋白提取）用TBS（Tris缓冲液）冲洗细胞三次，最后一次吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前加入蛋白酶抑制剂PMSF或cocktail），在培养板内3-5分钟。反复晃动培养板，使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。冰浴30分钟，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 12000g离心5分钟，收集上清，即为总蛋白溶液。样品分装冻存于-20℃备用。 𐟓Œ 注意事项及原理为什么用TBS而不是PBS？PBS是磷酸盐缓冲液，虽然用途广泛，但容易与钙离子镁离子络合形成沉淀，还会抑制某些生物化学过程。而Tris缓冲液对生物化学过程影响很小，且不与钙离子镁离子发生作用。希望这篇攻略能帮到你，祝你实验顺利！𐟒ꀀ

WB条带问题？速看解决！ 𐟍€12. 边缘条带弯曲（图3） 𐟌𘥎Ÿ因：电泳电流不均匀 𐟌𘨧㥆𓥊ž法：更换新的电泳槽；避免使用两遍的两孔 𐟌𘧻验：通常使用10孔的胶，如果上样刚好10个孔，最两头的两个孔肯定会弯曲。建议上样在胶的中间，这样电场会更均匀。 𐟍€11. 条带呈哑铃状（图2） 𐟌𘥎Ÿ因：胶配置问题 𐟌𘨧㥆𓥊ž法：确保胶配置正确，不合格的胶坚决不用 𐟌𘧻验：哑铃状条带最常见的原因是胶配置不当，凝固后不均匀。另一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，杂质沉积在孔的中间，蛋白被推挤到两边。 𐟍€10. 条带变形（图1） 𐟌𘥎Ÿ因：SDS PAGE胶中有气泡或杂质 𐟌𘨧㥆𓥊ž法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体 𐟌𘧻验：很多实验室使用的设备可能不是最新的，比如配胶用的海绵垫，用久了会从下面往上面漏小气泡。当气泡足够小时，它们会停留在胶内，影响后续的跑胶。另外，配胶用的水、SDS、Tris缓冲液要注意不要有杂质。

WB实验全解析，速藏！ 𐟔젥ꌥŽŸ理简单来说，Western Blot（WB）实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）把细胞或组织样本中的蛋白质分离出来。然后，这些蛋白质被转移到固相支持物上，比如PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）或NC膜（硝酸纤维素膜）。这些固相载体通过非共价键吸附蛋白质，同时保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。接下来，用特异性抗体（一抗）与目标蛋白结合，再用辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体与之反应。经过底物显色，分析曝光条带的位置和灰度，就能知道目标蛋白在样本中的表达情况啦。 𐟓 实验流程样本制备：包括蛋白质提取、定量和变性。 SDS-PAGE凝胶电泳：让蛋白质在凝胶中分离。转膜：通过电转将蛋白质转移到固相支持物上。封闭：用脱脂牛奶或BSA封闭膜上的非特异性位点。一抗、二抗孵育：让抗体与目标蛋白结合。 ECL化学发光检测：显影。胶片灰度分析及数据处理：用内参作为特定蛋白进行半定量分析。 𐟧ꠥꌥ™覝垂直电泳仪转膜仪化学发光成像仪 𐟓– 详细步骤及注意事项样本制备贴壁细胞总蛋白提取：用TBS（Tris缓冲液）冲洗细胞三次，最后一次彻底吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂PMSF或cocktail）于培养板内3-5分钟。期间反复晃动培养板，使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。冰浴30分钟，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。12000g离心5分钟，收集上清，即为总蛋白溶液，样品分装冻存于-20℃备用。注意事项及原理：为什么用TBS而不是PBS？PBS是磷酸盐缓冲液，虽然适用范围广，但容易与钙离子镁离子络合形成沉淀，还会抑制某些生物化学过程。相比之下，Tris缓冲液对生物化学过程影响很小，且不与钙离子镁离子发生作用。希望这篇讲解能帮到你！如果觉得有用，记得点赞哦～

𐟧엥stern blot转膜全攻略✨ 𐟔探索Western blot的奥秘，今天我们来揭秘转膜的原理与步骤！𐟔 𐟒ᨽ쨆œ原理𐟒እˆ駔觔𕥜𚥊›，凝胶中的蛋白质在电流作用下被释放，并通过与转印膜的相互作用，被牢牢吸附和固定在膜上。这样，蛋白质就成功地从凝胶转移到了转印膜上，且保持了其在凝胶中的相对位置哦！𐟒ꊊ𐟓转膜步骤大揭秘𐟓 1️⃣ 准备转印装置：有半干法、全干法和全湿法三种选择。半干法快速方便但可能损失高分子量蛋白；全干法损失少但速度慢；全湿法则适合大面积转印，但速度最慢。 2️⃣ 调制转印缓冲液：甘氨酸缓冲液通用但可能导致蛋白迁移不均；Tris缓冲液稳定但可能导致低分子量蛋白迁移不完全。 3️⃣ 处理凝胶和转印膜：根据方法不同，有平衡、活化等处理方式。活化是让PVDF膜在无水甲醇中浸泡，增加吸附能力哦！ 4️⃣ 组装转印夹层：顺序很重要！电极-滤纸-凝胶-转印膜-滤纸-电极（半干法）；电极-垫片-滤纸-凝胶-转印膜-滤纸-垫片-电极（全干法）；海绵-滤纸-凝胶-转印膜-滤纸-海绵（全湿法）。确保紧密贴合，无气泡和干燥哦！ 5️⃣ 进行转印：选择合适的转印条件，如电压、电流、时间。电压高、时间长则转印效率高，但可能导致低分子量蛋白过度迁移；电压低、时间短则效率低，可能导致高分子量蛋白不完全迁移。 𐟎‰完成以上步骤，你的Western blot转膜就成功啦！快去检测吧！𐟎‰

TBST和PBST的区别及配制方法 𐟧ꥮž验室小白的笔记 TBST和PBST的区别 TBST是TBS加Tween-20的缩写，而PBST则是PBS加Tween-20。两者的区别主要在于pH值和用途。 1. pH值变化：TBST的pH值随温度变化较大，而PBST容易有沉淀。如果需要反复使用抗体，建议使用TBST，因为它更稳定。洗液效果：两种洗液在洗脱蛋白时效果相似，都能提供稳定的pH环境，并有助于蛋白的洗脱。PBST是基于磷酸盐缓冲液，而TBST是基于Tris缓冲液。 TBS缓冲液 TBS缓冲液是生物学中常用的等渗缓冲盐溶液，主要用于免疫组化、原位杂交和酶联免疫等实验中，清洗免疫印迹实验中非特异性结合的抗体等。它的配方（1X浓度）包括：1L的10X PBS缓冲液（1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Tris, pH 7.4），加入0.1%的Tween-20（1 mL/L PBS），再补足至1L以获得最终浓度。配置步骤如下：首先，用蒸馏水稀释10X PBS至1X，再加入Tween-20，混合均匀后过滤或离心去杂质。最后，分装到无菌瓶中，存放在4℃的阴凉处，避免反复冻融。 PBS缓冲液 PBS缓冲液是指磷酸缓冲液（Phosphate Buffer Solution），渗透压近似于生理条件又有很强的pH缓冲能力，常用来洗细胞（不易涨裂）和作为细胞培养的基础液（pH缓冲）。它的配方为10X PBS（1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH 7.4），稀释至1X后加入0.1% Tween-20。与TBST相似，配制后过滤，分装并保存在适宜条件下。总结 TBST和PBST在实验室中都有广泛的应用，但它们在pH值和用途上有所不同。选择哪种洗液取决于你的具体实验需求。希望这些信息对你有所帮助！

免疫组化操作指南：试剂与步骤详解免疫组化是一种在医学实验室中广泛使用的技术，用于检测组织样本中的特定蛋白质。以下是进行免疫组化实验所需的各种试剂和操作步骤的详细说明。 𐟧꠨‰‚准备 PBS缓冲液（pH 7.2-7.4）：NaCl 37mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。柠檬酸钠缓冲液（CB，pH 6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。 EDTA缓冲液（pH 8.0）：在700ml水中溶解186.1g EDTAⷲH2O，用10mmol/L NaOH调至pH 8.0，加水至1000ml。 TBS缓冲液（pH 8.0）：在800ml水中溶解121g Tris碱，用1N HCl调至pH 8.0，加水至1000ml。酶消化液： 0.1%胰蛋白酶：用0.1% CaCl2（pH 7.8）配制。 0.4%胃蛋白酶液：用0.1N HCl配制。 3%甲醇-H2O2溶液：用30% H2O2和80%甲醇溶液配制。封裱剂：甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.0-9.5）等量混合。油和TBS（或PBS）配制。 TBS/PBS缓冲液 𐟔젦“作步骤组织处理：将组织样本固定在甲醛或酒精中，然后进行脱水、透明化和石蜡包埋。切片：将石蜡包埋的组织切成薄片，并进行展片、粘片和烤片。酶消化：使用胰蛋白酶或胃蛋白酶进行组织消化，以暴露抗原。封闭：用正常血清或BSA封闭非特异性结合位点。一抗孵育：将一抗与组织切片孵育，使抗体与抗原结合。二抗孵育：用标记的二抗与一抗结合，形成抗原-抗体复合物。显色：使用DAB或其他显色剂进行显色反应，观察阳性信号。封片：用中性树脂封片，保存结果。通过以上步骤，你可以进行免疫组化实验，检测组织中的特定蛋白质。希望这份指南能帮助你更好地理解和执行免疫组化实验。

SDS-PAGE缓冲液，简单配方！在进行SDS-PAGE电泳时，使用合适的上样缓冲液至关重要。以下是一个简单而有效的5xSDS-PAGE Loading Buffer的配方，帮助你更好地分离和可视化蛋白质。 𐟓 配方组分： 250mM Tris-HCl（pH 6.8） 10%（W/V） SDS 0.5%（W/V） BPB 50%（V/V）甘油 5%（W/V） 巯基乙醇 𐟔젩…制步骤：将1.25mL 1M Tris-HCl、0.5g SDS、25mg BPB和2.5mL甘油混合在10mL塑料离心管中。加入去离子水，搅拌至完全溶解，然后定容至5mL。将混合物分装成500的小份，室温保存。使用前，向每小份中加入25的2-ME，并搅拌均匀。加入2-ME的Loading Buffer可以在室温下保存一个月左右。 𐟓 注意事项：确保所有试剂都是新鲜的，并且没有受到污染。在使用前，检查所有试剂的浓度和纯度。通过以上步骤，你可以轻松制备出高质量的SDS-PAGE上样缓冲液，为你的蛋白质研究提供有力的支持。

实验室常见缓冲液配制指南 𐟍 实验室常用缓冲液的配制方法 10 mM ATP缓冲液组份浓度：10 mM ATP 配制量：20 ml 配制方法：称取121 mg Na2ATPⷳH2O，加入到50 ml塑料离心管内。加入20 ml的25 mM Tris-HCl（pH 8.0），搅拌溶解。适量分成小份后，-20℃保存。 1M DTT缓冲液组份浓度：1M DTT 配制量：20 ml 配制方法：称取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料离心管内。加入20 ml的0.01 M NaOAc（pH 5.2），溶解后使用。通过0.22 um滤器过滤除菌。适量分成小份后，-20℃保存。这些缓冲液的配制方法简单易懂，适用于各种实验室实验。希望这些信息对你有所帮助！

自制蛋白上样缓冲液，WB实验更稳定！自从进入实验室，我发现大部分实验试剂都是自己配置的，尤其是Western blot实验的一整套试剂，从头到尾都是自配的，非常稳定，实用效果非常好！今天就来分享一下如何配置各种蛋白上样缓冲液。 5xNative-PAGE Loading Buffer 𐟌🊥œ訿›行天然蛋白的研究分析时，需要使用非变性的蛋白上样缓冲液来处理样品，以保持蛋白的天然活性。相比变性的蛋白上样缓冲液，它不添加去垢剂和还原剂。以下是5xNative-PAGE Loading Buffer的配方（10 mL）： 0.25M Tris-HCL (pH 6.8) - 1M Tris-HCL (pH 6.8) 2.5mL 溴酚蓝 (BPB) - 0.5%（WM）0.05g 甘油 - 50%（WM）5mL dH₂O - 2.5mL 配置步骤：将所有组分混合均匀。室温或不超过37℃的水浴中溶解非变性蛋白，然后立即放置室温，尽量避免长时间水浴。各组分的作用 𐟔 十二烷基硫酸钠 (SDS)：破坏蛋白质的二级和三级结构，使其去折叠，覆盖蛋白质本身的电荷，赋予蛋白质净负电荷。同时与硫醇试剂一起使蛋白质线性化，电泳时蛋白质的分离只与分子大小有关。还原剂：如巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），用于减少含硫氨基酸（如半胱氨酸）之间产生的二硫键。此外，由于硫醇剂具有抗氧化特性，能够防止半胱氨酸的氧化。与SDS发挥协同作用，使蛋白质线性化。甘油：增加样品的密度，发挥样品沉降作用。 Tris-HCL：维持pH在6.8左右，防止在低温保存的过程中蛋白质肽键断裂，保证了蛋白质的稳定性；同时，Tris可以抑制酶促反应并防止蛋白酶降解蛋白质。溴酚蓝：指示样品在凝胶中的位置。自制蛋白上样缓冲液不仅稳定，而且可以根据实验需求进行调整，确保实验结果的准确性。希望这些配方和步骤对你有所帮助！

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