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293细胞前沿信息_免疫组化ki67大约30%(2024年12月实时热点)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：教程更新日期：2024-11-30

293细胞

泛素化检测秘籍𐟔 𐟌ˆ 如何检测蛋白质是否泛素化？通过免疫共沉淀（CO-IP）方法，可以将特定蛋白质及其结合的蛋白质分离出来。分离后的蛋白质经过SDS电泳和Western blot分析，可以明确哪个蛋白质的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 𐟌Ÿ 实验步骤 1️⃣ 细胞接种与转染接种HEK293细胞，当细胞密度达到40-60%时进行转染。除了目的质粒外，还需转染0.75ug的泛素分子Ub。转染体系包括10ug质粒、20ul转染试剂和400ul高糖完全培养基。 2️⃣ 细胞裂解用胰酶消化细胞，将其转移到1.5ml离心管中，3500rpm离心5分钟，去除培养基。用PBS清洗细胞，重复两次。 3️⃣ 蛋白提取向离心管中加入100ul RIPA裂解液和10ul 10%的SDS，混匀后100Ⰳ煮10分钟，以解除被泛素化蛋白与其他蛋白的结合。 4️⃣ 超声破碎细胞向离心管中加入900ul RIPA裂解液和10ul PMSF，冰上放置30分钟，12000rpm 4Ⰳ离心10分钟。 5️⃣ 蛋白与磁珠结合取1ml IP Wash Buffer于离心管中，缓慢混匀后加入10ul磁珠，放置于磁力架上3分钟，吸弃IP Wash Buffer，重复清洗磁珠三次。 6️⃣ 免疫共沉淀取900ul上述所得裂解液于含磁珠的离心管中作为IP组，置于旋转仪上4度旋转过夜。剩余的细胞裂解液作为Input，保存于-20Ⰳ。 7️⃣ 清洗磁珠第二天将离心管置于磁力架上3分钟，磁珠吸附完毕后吸弃离心管中的溶液。每管加入1ml IP Wash Buffer，旋转仪置于4Ⰳ冰箱中旋转5分钟，吸弃IP Wash Buffer，重复清洗3次。 8️⃣ 煮样向Input组中加入25ul的5xLoading Buffer，IP组加入80ul用RIPA裂解液稀释的1㗌oading Buffer，振荡混匀后再瞬离，在震荡金属浴中100Ⰳ煮10分钟，震荡频率为1000rpm。

生物试剂百人计划试用，快来申请！各位学长学弟们，大家好！今天给大家带来一个超棒的机会——生物试剂百人计划试用！无论你是实验室小白还是资深科研达人，都可以来试试哦！特级胎牛血清：细胞培养的秘密武器 𐟐‚ 首先推荐的是我们的特级胎牛血清。这可是细胞培养的黄金标准，选它准没错！无论是部分原代细胞、干细胞还是肿瘤细胞系，都能轻松搞定。进口的来自乌拉圭，血源地纯净，质控严格，可追溯性超强。国产的也有，适合增殖旺盛的常规细胞系。 ProGroTM无血清培养基：干细胞的摇篮 𐟌𑊊接下来是ProGroTM无血清培养基，特别是为干细胞培养量身定做的。比如ProGroTM MSC KIT，专为间充质干细胞设计，用于人脐带间充质干细胞的原代分离和传代培养。还有ProGroTM CIK KIT和ProGroTM NK KIT，分别适用于免疫细胞的体外扩增和NK细胞的刺激活化。工程细胞培养：抗体生产的得力助手 𐟒‰ 如果你是做工程细胞培养的，那ProGroTM HybriSFM和ProGroTM 293SFM绝对是你的好帮手。前者用于杂交瘤细胞抗体生产，后者则适合293细胞的高密度无血清培养和蛋白表达。还有CHO无血清培养基和CHO-CD3 SFM，分别适用于CHO细胞的培养和转染。昆虫细胞培养：重组蛋白表达的好选择 𐟐› 昆虫细胞培养也是科研中的一大领域。ProGroTM InsectSFM适合Sf9及Sf21细胞的高密度悬浮培养及重组蛋白表达。还有TC-100昆虫培养基，适用于大部分鳞翅目昆虫细胞系。辅助试剂：让实验更高效 𐟧ꊊ最后推荐的是ProGroTM辅助试剂，特别是重组胰蛋白酶。这可是通过基因工程技术生产的非动物源性重组丝氨酸蛋白酶，纯度高、分子稳定、活性优异，而且生物安全性极高。还有普通的胰蛋白酶，适用于细胞解离、细胞传代和原代组织的解离。让我们一起在科学的道路上探索未知的领域！𐟚€

腺相关病毒：基因传递的温和使者 𐟌𑊨…𚧛𘥅𓧗…毒（AAV）是一类小巧的病毒，它们的基因组是单链DNA，能够感染分裂细胞和非分裂细胞。AAV通常需要腺病毒或疱疹病毒的帮助，才能在体内复制和扩增。重组腺相关病毒（rAAV）是通过将AAV2型基因组与不同血清型的衣壳蛋白基因组结合，产生的一种混合体病毒载体。这种载体可以将目的基因的CDS区序列或RNAi干扰序列插入rAAV表达质粒中，然后通过感染细胞来完成对目的基因的操作。在质粒转染生产rAAV的系统中，被转染的质粒主要有三种功能：作为目的转基因载体；表达调节AAV复制的Rep基因和包装AAV病毒的Cap基因；以及促进AAV复制、翻译和包装的辅助病毒功能。在实际生产过程中，通常采用三质粒共转染系统或二质粒共转染系统（将Rep、Cap和Ad辅助元件结合）来生产rAAV。在质粒共转染生产rAAV的系统中，被转染的细胞一般使用HEK293细胞，因为它拥有两个必需的腺病毒基因：Ela和EI3。腺相关病毒具有感染温和、免疫原性小、长效稳定表达的特点，主要应用于动物体内注射。

案例应用丨C.BIRD™技术：加速HEK293细胞株生长与蛋白产量

Lipo2K转染秘籍𐟔劣## 转染前的准备工作 𐟧ꊧ𛆨ƒž铺板密度：这个可是关键！根据Lipofectamine 2000（Lipo2K）的说明书，不同孔板的铺板密度有不同的建议。我用的是12孔板，铺板密度是2㗱05cells/孔。大概培养20小时后，细胞密度可以达到60-70%。转染前一定要检查细胞的生长状态，浓度最好在60-70%之间。太稀的话，转染后细胞会死亡（虽然我有一篇笔记里转化效率高，但因为细胞密度低，结果部分细胞死了）；太浓的话，转染试剂无法有效输送到每个细胞中。铺板的均匀度：这个对我来说是个难题。底部细胞密集而四周稀疏会影响转染效果。我最近发现一个有效的方法，就是把稀释好的细胞悬液充分混匀，加入孔板后不要晃动，静置5-10分钟。这样铺出来的板子特别均匀！不过我只在24孔板和12孔板这样试过，96孔板可能还是需要敲打一下。培养时间：铺完板子后大约16-24小时就可以做转染了，注意观察细胞状态。培养基是否含抗生素：说明书建议使用不含抗生素的培养基铺板，但对于293T细胞来说，含抗生素的培养基也可以使用。质粒DNA转染 𐟌€ 准备质粒：这个过程一定要保证卫生！质粒的量：根据说明书给出的建议质粒用量和Lipo2K用量，实际用量可以根据需求调整。制备复合物（以12孔为例）：使用50 不含血清的Opti-MEM I培养基（或其他不含血清的培养基）稀释1ug DNA。轻轻混匀。使用前轻轻混匀Lipo2K，然后取4在50  Opti-MEM I培养基中稀释。混合（1）和（2）（总体积=100）。轻轻混匀并在室温下孵育15-20分钟（溶液可能变得浑浊）。注意：Lipo2K加入后会开始产生纳米球，应尽快将稀释好的Lipo2K加入混匀的质粒中。将100 复合物轻轻添加至含有待转染细胞的孔中。通过轻柔的摇动平板轻轻混匀。培养基可在4-6小时后更换（换液有助于减少Lipo2K转染导致的细胞毒性，对于293T细胞，不换也可以）。将培养板放回细胞培养箱即可。18-48小时可见GFP表达。希望这些步骤能帮到你，祝你实验顺利！𐟚€

293T细胞培养全攻略，你掌握了吗？ 293T细胞，全名是HEK-293T，是一种经过人腺病毒5型（Ad5）转染后永生化的人胚肾细胞系。它的特点是含有并表达Ad5基因，而且比普通的293细胞更容易转染，因此被广泛用于病毒包装和基因表达研究。细胞培养要点 𐟓š 培养基选择：293T细胞专用培养基是关键。通常使用DMEM-H培养基，加入10%的胎牛血清（FBS）和1%的青霉素-链霉素（P/S）。传代比例：一般每2-3天换液一次，传代比例为1:4-1:8，传代周期大约是24-48小时。培养条件：细胞在95%空气+5%二氧化碳（CO2）的气相条件下生长，温度保持在37℃。冻存条件：细胞冻存时，推荐使用60%的基础培养基、30%的FBS和10%的DMSO，液氮储存。细胞特性 𐟔슨𔴥て€篼š293T细胞的贴壁性较差，容易飘起来。建议在培养前进行包被，或者尝试提高血清比例。增殖速度：细胞增殖非常快，通常倍增时间不到一天，隔天即可长满。聚团现象：细胞容易聚团，换液时要小心操作，避免用力摇晃培养瓶。消化与传代 𐟌€ 消化：293T细胞容易消化，但消化下来的细胞容易成团。需要吹打吹散，否则传代后细胞会成团生长，影响实验结果。传代操作：当细胞生长至汇合率达到80~90%时，需要进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。注意事项 ⚠️ 随着传代次数增加，293T细胞可能会出现生长状态下降或突变等情况。因此，建议在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。通过这些细节，你可以更好地掌握293T细胞的培养技巧，为你的实验打下坚实的基础。

显微镜图片手动添加标尺的正确方法今天我们来聊聊一个常见的问题：用显微镜拍了照片，但没加标尺，后来想自己手动加标尺，这样做对吗？我之前用荧光倒置显微镜拍了一些细胞图片，但在添加标尺时发现软件里自带了好几个标尺，每个标尺都不一致，显得很乱。我猜是之前被同学调整过，导致标尺不准确，所以不想用。于是我决定自己动手查查怎么手动添加标尺。我查到了两种方法，下面我来详细说说：方法一 𐟓 这种方法的核心思想是，你的片子实际放大了多少倍（比如物镜是20X，目镜是10X，那么你的片子就放大了100倍），你想添加的标尺就放大多少倍。比如你想在图片上添加100微米的标尺，那么你用PS在你的照片上画1cm的线段，并标注这个线段是1微米（放大倍数是100倍）。方法二 𐟓 这种方法是根据分辨率将长度单位换算成像素。具体步骤是，先测量已知尺寸的参照物（比如显微镜下的微标尺），然后根据这个参照物的实际尺寸和图像中的像素长度来计算比例。实际操作中的问题 𐟘“ 看起来这两种方法都很简单，但实际操作起来却有点麻烦。我自己动手画了一下，发现大小不对。比如一个293T细胞的直径竟然有300微米长！这显然不对。为什么会出现这种情况呢？ 𐟤” 显微镜的光学误差：显微镜的实际放大倍率可能与标定值有轻微偏差，光学系统中的透镜畸变会影响图像的精确性。屏幕显示和DPI设置：分辨率值如96 DPI（dots per inch）通常是屏幕显示参数，可能不直接反映显微镜拍摄图像的真实比例。缺少直接校准：不同显微镜和相机组合下的实际分辨率与理想值可能有差距，单纯依赖分辨率不能反映这些差异。解决方案 𐟛 ️ 使用微标尺校准：在显微镜下拍摄一个已知尺寸的微标尺图像，导入到图像处理软件中进行校准。这样你可以获得图像中实际像素与物理距离的准确比例。图像元数据和显微镜软件：有时显微镜软件会嵌入与图像相关的放大信息或比例数据。检查和使用这些信息有助于更准确地绘制标尺。手动验证：使用已知尺寸的参照物（如显微镜下的微标尺）在图像中测量实际像素长度，并用它作为比例基础绘制标尺。希望这些方法能帮到你，让你在显微镜图片中添加标尺时更加准确和高效！

IP 实验小贴士：从细胞准备到蛋白分离大家好，好久不见！最近我在做IP实验，感觉有些心得可以分享给大家。虽然我只是一个普通的研究生，但如果有不同意见，欢迎交流，别喷我哦，我可是有钢化玻璃心的~ 细胞准备 𐟧슩斥…ˆ，IP实验需要大量的细胞，尤其是内源性IP。我一般会准备10cm的培养皿，细胞数量足够多才能保证实验效果。如果是外转293细胞，六孔板的一个孔也够用。瞬转的话，48小时后收集细胞，弃去培养基，用预冷的PBS清洗两遍，再加裂解液。裂解液选择 𐟧𔊨エ磦𖲧š„选择也很重要。如果互作特别强，用RIPA裂解液可以，但如果不确定互作强弱，用IP专用裂解液会更好。我自己配过几个配方的IP裂解液，因为不同细胞系和蛋白的最适裂解pH不同，需要做预实验摸索。当然，市面上也有商品化的IP裂解液，大家可以在评论区互相推荐一下~ 裂解过程 𐟕𐯸 裂解过程一般在4度摇床上或冰上进行，我一般会裂解1小时（前提是裂解液比较温和）。如果是RIPA裂解液，时间不要太长。裂解后，如果是核蛋白，可以超声一下，但不要起太多泡沫，超声探头放在EP管底部但不接触。裂解后刮下细胞，转移到1.5ml的EP管中，12000rpm离心15分钟，取上清。蛋白分配 𐟧슨›‹白分配也很关键。我一般会取50ul作为input，450ul作为IgG，450ul作为IP组。input中加入蛋白loading buffer，98℃煮样10分钟，-20℃保存。IgG和IP样品中加入相应抗体进行孵育。 pre-clear 𐟧𜊨🙤𘀦�˜露𚤺†清除背景，使条带更干净。在IgG和IP样品中加入抗体IgG（1:200）和磁珠，室温孵育2小时。结束后磁吸转移上清，弃磁珠。以上就是我今天分享的IP实验小贴士，希望对大家有帮助！之后的步骤我会在下一篇文章中继续分享~

慢病毒包装全攻略：从细胞培养到病毒收集 𐟓– 细胞分盘：首先，用胰酶消化收集293T细胞，并将其接种到100mm的培养皿中（根据实验需求）。将细胞放入含有5%CO2的37℃细胞培养箱中培养8-24小时。当细胞贴壁且密度达到培养皿总面积的80%以上时，进行转染。 𐟧ꠥ‡†备质粒和脂质体：吸弃293T中的培养液，加入4ml新鲜完全培养基。然后，将目的质粒和包装质粒混合。在一个无菌的1.5ml EP管中，加入250⵬无血清DMEM，加入12ⵧ目的质粒、9ⵧ psPAX2和9ⵧ pmd2.G。在另一个EP管中，加入250⵬无血清DMEM和30⵬ lipo2000，静止5分钟后，将两管充分吹打混匀，静置15分钟。 𐟕𐯸 孵育：将500的混合液逐滴加入细胞培养皿中，确保均匀滴入培养皿的各个部分。轻轻摇动培养皿，使其混匀后，继续置于含有5%CO2的37℃细胞培养箱中孵育。 𐟌€ 换液：8-12小时后，加入10ml预热过的完全培养基，注意不要冲刷掉已经贴壁的细胞。加入完全培养基后，继续将细胞放置在细胞培养箱中孵育。 𐟧Š 收集病毒上清：转染后24小时和48小时左右，收集含有慢病毒的上清液放入离心管中。用1500rpm离心10分钟去除杂质，或者使用0.45um滤器过滤后分装冻存于-80℃。避免反复冻融。或者将离心或过滤后的上清液加入病毒浓缩管中浓缩后分装。 𐟦 病毒感染：将细胞平铺于35mm培养皿，12-24小时后换液，最佳密度为50%。加入收集的病毒上清液和适量polybrene进行培养。细胞长满后传代或检测表达。

细胞免疫共沉淀实验（Co-IP）全攻略细胞免疫共沉淀实验（Co-IP）是一种研究细胞内蛋白质相互作用的重要方法。其基本原理是，如果细胞内两种蛋白质（A和B）有直接或间接的相互作用，那么在温和的裂解条件下获得的蛋白样品中加入A蛋白的抗体，可以将A蛋白沉淀下来，与其直接或间接相互作用的B蛋白或C蛋白也会一起被沉淀下来。通过Western blot检测沉淀中是否存在B或C蛋白，可以确定B或C蛋白与A蛋白的相互作用。 𐟔 用途检测A、B蛋白在体内是否相互结合分离与A蛋白相互作用的蛋白复合物 𐟧ꠦ料与仪器【样品和试剂】 293T细胞（以该细胞做转染为例）转染质粒（Flag-A，HA-B） Flag抗体 2㗠loading buffer PBS Flag-beads 1㗠TBST 5㗠SDS loading buffer 蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂A和B RIPA裂解液【实验仪器】磁力架金属浴 RIPA裂解液旋转混合仪 WB实验相关设备 𐟓 实验步骤一、细胞的铺板与转染提前一晚将293T细胞铺板至6cm皿中，铺板量以达到相应的转染试剂要求为准；用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染2皿细胞：Flag空载+HA-B；Flag-A+HA-B；每质粒2微克。二、免疫沉淀转染24小时后，收获细胞，每皿加入500裂解液，收集细胞至1.5mL EP管中，在冰上超声破碎细胞；超声好后，4℃，12,000g，离心30分钟，取400上清液用于免疫沉淀，80上清用作总蛋白并加入等体积的2㗠loading buffer；将400上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中，加入0.3-0.5 Flag抗体，4℃孵育3-4小时； 4℃，2,000g，离心3分钟，去除未结合的液体，留下beads沉淀，用预冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次，每次5分钟；最后一次去除清洗液，往沉淀中加入602㗬oading buffer，和总蛋白一起在沸水中煮沸15分钟。三、Western Blot检测通过SDS-PAGE分离样品，利用全蛋白样品作为对照，检测Flag-A和HA-B蛋白是否发生结合。 ⚠️ 注意事项对于内源的Co-IP检测应该用10cm皿来培养目的细胞，并维持较好的生长状态；如果该实验用于新蛋白的鉴定，应注意抗体重链和轻链的影响；该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。

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