当前位置：网站首页 » 热点 » 内容详情

引物长度最新视觉报道_引物长度mer和bp的区别(2024年11月全程跟踪)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：热点更新日期：2024-11-27

引物长度

Pfu酶和Taq酶：谁更适合你的实验？在分子生物学实验室里，选择合适的DNA聚合酶可是个大学问。今天，咱们就来聊聊两种广受欢迎的酶：Pfu酶和Taq酶。 Pfu酶：高保真性的秘密武器 𐟔犊Pfu酶，全名Pfu DNA聚合酶，是从一种叫火球菌属的嗜热古核生物中发现的。这家伙能在活体内复制DNA，简直是生物界的“小能手”。Pfu酶不仅有5’-3’的DNA聚合酶活性，还有5’-3’的外切核酸酶活性。特别是它的3’-5’外切酶活性，让它在PCR扩增过程中出错的几率大大降低，保真性是传统Taq酶的10倍！ Pfu酶的优势 𐟌Ÿ 高保真性：Pfu酶的外切核酸酶活性让它成为PCR反应中的“错配率低能手”，特别适合那些对保真性要求高的实验。热稳定性高：Pfu酶的热稳定性不输Taq酶，能在高温下保持活性，确保PCR反应顺利进行。产物特点：与Taq酶不同，Pfu酶扩增的PCR产物是平端，没有3'端A突出，这需要额外的处理步骤才能进行TA连接。使用建议 𐟒ኩœ€要高保真性的PCR反应：比如克隆PCR、DNA片段拼接等，Pfu酶是你的不二选择。提高扩增效率：可以试试将Pfu酶与Taq酶按一定比例混合使用，取两者之长。引物设计：在使用Pfu酶进行PCR反应时，适当增加引物长度，并尽量减少由3'-5'外切酶活性引起的引物降解。 Taq酶：PCR技术的“功臣” 𐟏… Taq酶，全名Taq DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermus Aquaticus）中分离出来的。它的出现极大地推动了PCR技术的发展，让PCR反应能在高温下连续进行多个循环而不失活，简化了操作过程并降低了成本。 Taq酶的优势 𐟌᯸ 热稳定性强：Taq酶能耐受90℃以上的高温，是PCR技术得以广泛应用的关键。扩增效率高：Taq酶在PCR反应中具有较高的扩增效率，能快速复制目标DNA片段。 3'端带A：Taq酶扩增的PCR产物3'端会带有一个额外的A碱基，形成黏性末端，便于进行下游的TA连接。注意事项 ⚠️ 尽管Taq酶在PCR反应中表现出色，但其保真性相对较低，这主要是由于其缺乏3'-5'外切酶活性，无法及时纠正错误掺入的碱基。因此，在需要高保真性的实验中，Taq酶可能不是最佳选择。总结 𐟓 Pfu酶和Taq酶各有千秋，选择哪种酶取决于你的实验需求。如果你需要高保真性，Pfu酶是你的不二选择；如果你追求的是扩增效率和简便操作，Taq酶会更适合你。希望这些信息能帮到你，让你的实验更加顺利！

𐟔젒T-PCR实验全攻略：从原理到实践 𐟓š 目录 cDNA与反转录 RT-PCR原理与目的 RNA抽提与质量检测反转录过程 PCR程序与引物设计 PCR酶与体系 PCR产物检测实时荧光定量PCR（RT-qPCR）常见问题与注意事项 𐟔젣DNA与反转录 cDNA（互补DNA）：与RNA链互补的单链DNA。在适当引物的存在下，由DNA聚合酶即反转录酶合成的单链DNA就是cDNA。反转录（Reverse Transcription）：在反转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA的过程。合成的DNA链称为与RNA互补的DNA，即cDNA。 𐟔젒T-PCR原理与目的原理：RT-PCR全称反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction），将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。目的：检测核酸的表达，主要是RNA的表达。DNA不需要反转录的过程，直接PCR检测即可。 𐟔젒NA抽提与质量检测 RNA抽提方法：TRIzol法。主要成分包括苯酚，用于裂解细胞和变性蛋白。 RNA质量检测：分光光度计测定、凝胶电泳法。 𐟔젥转录过程以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中，遗传信息的流动方向与转录时相反，因此称为“反转录”。需要反转录酶，合成的DNA称为与RNA互补的DNA（cDNA）。根据不同情况选择不同的反转录引物。 𐟔점CR程序与引物设计 PCR程序：三步法，包括变性、退火和延伸三个基本反应。引物设计：找到目的基因的CDS序列，用软件设计和评价引物，并使用BLAST进行引物特异性检测。引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作；3'-端的Tm值要低于5'端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。 𐟔점CR酶与体系 PCR酶：可选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。 PCR体系：按所选的PCR酶说明书来配制。 𐟔점CR产物检测一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 𐟔젥—𖨍祅‰定量PCR（RT-qPCR）基本原理：在PCR体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过对PCR过程中产生的荧光信号累积或荧光标记的特异性探针释放的荧光信号进行监测和记录，实时监测整个PCR进程，再结合软件对获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品中特定DNA片段的初始量。扩增过程：包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。常见问题与注意事项：在进行RT-PCR实验时，需要注意实验条件的选择、引物的设计、RNA的质量控制以及实验操作的规范性等问题，以确保实验结果的准确性和可靠性。

PCR常见问题及解决方法全解析 PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应，是生物领域中最基础且重要的一环。它通过变性、退火、延伸等步骤，在DNA聚合酶的催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。 PCR反应体系中包含几个关键成分：模板（Template）：可以是基因组、质粒DNA、cDNA，甚至是细菌或组织样品。引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性，并确定引物长度。 DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动PCR反应进行的“机器”。缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。脱氧核苷酸（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，是DNA的基本组成元件。 Mg、K离子增强剂：增强PCR反应的效果。在实际操作过程中，PCR可能会遇到多种问题，如PCR产物条带拖尾、有杂带，甚至完全没有条带等。以下是一些常见问题及其原因：完全没有条带试剂质量问题或加样错误：导致反应体系不完整。模板DNA问题：模板与引物无法结合。引物或反应温度设计不合理：引物特异性差或退火温度不合适。有很多非特异性条带反应体系污染：反应体系被污染。引物特异性差：引物特异性差。退火温度不合适：退火温度不合适。目的条带弱聚合酶活性过低：聚合酶活性过低。循环次数偏低：循环次数偏低。模板DNA浓度过低：模板DNA浓度过低。 PCR产物出现片状拖尾 DNA聚合酶过多或酶活性差：DNA聚合酶过多或酶活性差。 dNTP和Mg离子浓度过高：dNTP和Mg离子浓度过高。退火温度过低或循环数偏多：退火温度过低或循环数偏多。模板DNA用量过大或模板不纯：模板DNA用量过大或模板不纯。引物特异性差或形成二聚体：引物特异性差或引物间形成二聚体导致非特异性扩增。了解了这些问题的原因后，就可以针对性地调整PCR条件，以获得理想的条带。希望这些信息能帮助大家在PCR实验中取得成功！

拟南芥突变体鉴定三引物法 𐟌𑤻妋Ÿ南芥（Arabidopsis thaliana）的ACD5基因为例，我们来学习如何使用Primer3 Plus设计引物吧！ 1️⃣ 首先，登录Ensembl plant数据库，选择拟南芥作为物种，并输入ACD5基因，点击“go”。 2️⃣ 在搜索结果中，点击选中的基因，再选择一个转录本和cDNA。 3️⃣ 点击“Configure this page”，然后显示外显子。 4️⃣ 下载cDNA序列，选择RTF格式，并包含行号。 5️⃣ 下载后，你会看到蓝色部分代表外显子。 6️⃣ 接下来，打开Primer3 Plus，将下载的序列粘贴进去，选择qPCR策略。 7️⃣ 在3’端选择两个外显子的连接处，将后面一个的第一位作为primer overlap position。 8️⃣ 进入“General Settings”，按照引物设计原则设置数值： - S代表上游引物，A代表下游引物。 - tm在58左右，正负2度（55-65），上下游引物Tm差最好不要超过5℃。 - GC%在40%-60%。 - 3’末端不能是A，最好是T。 - 不能有连续3个相同的碱基。 - 3’端一定不能有错配。 - 引物自身和引物之间不能有4个连续的碱基互补。 - 退火温度要适宜，温度高则扩增特异性强，温度低则扩增效率高。 - 引物长度一般在15-30个碱基。 9️⃣ 点击“Pick Primer”，即可获得引物。之后点击“previous”和“Next”查看上下引物，并检查是否有潜在的高级结构如发夹结构和二聚体。 𐟔Ÿ 最后，使用primer blast输入上下游引物，选择正确的库和物种，点击“Get Primer”，查看引物的长度、Tm值、GC含量等分析结果。确保引物不会匹配到同物种或不同物种的其他基因。

PCR 反应体系与反应条件有哪些？

构质粒90%成功的秘诀：超长引物的使用 𐟧젥ˆ学者都知道，引物设计有一条基本原则：引物长度不超过30bp，与目的基因互补序列15-20bp，以及3'端不能是GC等。但在实际操作中，我发现其实不需要严格遵守这些原则。现在的PCR酶效率非常高，退火温度用到70度完全没问题。 𐟧젦ˆ‘这里说的超长引物是指50-60bp，与目的片段互补序列或同源臂在30bp左右，退火温度直接用70度。这样的引物特异性非常好，与目的片段结合的效率很高，不容易形成引物二聚体，PCR几乎都能一次性成功。同源臂长重组效率也高，平板上长出来的菌大部分都是重组成功的，大大缩短筛选的时间。 𐟧젩‚㤹ˆ什么时候需要超长引物呢？ 1️⃣ 模板质量：如果模板是质粒，那么目的基因的浓度和纯度都非常好，互补序列在15-20bp之间都可以P出来（但依然有失败的概率，所以为了节省时间我都用长引物）。如果模板是cDNA，那么里面东西比较杂，浓度可能也不高，所以需要提高引物特异性，让它更容易捕捉到你的目的基因。 2️⃣ 引物容易形成二聚体：正反引物有不可避开的6-10bp的互补序列，可以通过延长引物的总长度，提高与目的基因结合的效率，避免引物二聚。 3️⃣ 同源重组失败：需要延长同源臂。 𐟧젥…𓤺Ž构质粒之前已经发过好几篇笔记，大家可以翻看。最近又收获了一些心得，我会进一步综合整理出来一个系列，希望对大家有帮助～

PCR实验走弯路？看这篇！ PCR和Western Blot一样，都是实验中常用的技术，但它们也常常会出现各种“意外”结果，让实验人员头疼不已。今天，我来分享一些常见的PCR问题及其解决方法，希望能帮你少走几条弯路。 𐟟ᦉ餸出目的条带：可能原因：模板问题：如果模板放置时间过长或反复冻融，可能会导致模板断裂或降解。建议使用新鲜制备的DNA模板，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。模板的GC含量过高也会影响扩增，建议更换适用于高GC含量模板的酶及相应的Buffer。模板中如果含有杂质或抑制物，特别是甲醛固定及石蜡包埋的组织中常含有甲酸，会导致DNA脱嘌呤。建议降低模板浓度。如果模板是cDNA，需确认逆转录所用的RNA的纯度和完整性。引物问题：引物设计不合理，如特异性不好，无法结合到模板上，或者结合到模板其他位置。反应程序：退火温度不合适，建议进行梯度摸索。延伸时间不足时，需适当延长延伸时间，可以根据酶的扩增速度和目的片段的长度进行计算。反应体系：蛋白酶或核酸酶污染，配制错误，建议重复实验，并以曾经扩增成功的模板和引物作为阳性对照。Mgⲫ浓度不合适，过高会降低反应的特异性，过低则影响产物量甚至导致扩增失败。酶的问题：反应温度过高，导致酶失活，建议使用热稳定性高的酶。运输、储存等不当导致酶失活。 𐟟ᩝž特异性条带：可能原因：引物特异性差：引物与模板发生非特异性结合，或者引物之间形成二聚体。建议重新设计引物。模板不纯、降解或过量：模板中污染了其他质粒，模板的完整性和纯度不够。反应程序：如果出现比目的条带大的杂带，可以缩短延伸时间；如果非特异性条带较小，可以提高退火温度。酶量过多：建议减少酶用量。 𐟟ᩫ˜保真PCR序列突变：可能原因：测序信号可信度：通常在测序反应的开始和结尾部分测序信号的可信度不高。模板类型：如果模板是质粒，需对模板进行测序。如果模板是cDNA，模板中可能带有突变。模板反复冻融或者长时间紫外照射都会导致模板序列突变。突变类型：如果多个测序样本的突变位置相同，可以排除酶的影响，因为酶导致的突变是随机的。 𐟟ᨷ‘胶条带有弥散或拖尾：可能原因：胶的问题：制胶时凝胶没有完全融化。模板及引物降解：模板及引物发生降解。酶的问题：酶用量过多。希望这些信息能帮助你更好地进行PCR实验，避免不必要的麻烦！𐟒ꀀ

𐟌𑠥𜕧‰騮𞨮᥅覔𛧕导š从理论到实践！引物设计的基本原则 𐟓œ 选择目的基因的共有外显子区域进行设计。引物长度建议在20到25bp之间，GC含量保持在40%到60%，Tm值最好在60℃左右。设计引物时，尽量跨越外显子，上下游引物可以位于不同的外显子上。引物的self complementarity和self 3' complementarity相加值应不超过8，单个值不超过5。扩增产物长度建议在80到300bp之间，最佳为80到150bp。避免设计含有4个或以上相同碱基（如AAAA、TTTT、GGGG、CCCC）的引物，以及避免明显的二级结构。设计流程 𐟖寸使用NCBI在线设计工具：进入NCBI网站，搜索目的基因（如GAPDH）。查看详细信息，找到共有外显子区域。选择转录本信息，查看外显子位置。进入引物设计页面，填写相关信息。设置引物参数，如PCR产物大小、跨越外显子等。点击“Get Primers”获取引物序列。结果解读 𐟓Š 在Graphical view of primer pairs部分查看每对引物跨越外显子的情况。在Detailed primer reports部分查看引物质量和匹配情况。通过以上步骤，你就可以轻松完成引物设计啦！𐟎‰

𐟓š今日学习心得与知识分享𐟓– 𐟚𝥜襎•所里也能学习！今天是休息日，我决定尝试一种新的背书方法。卡子姐推荐的自讲自听法，果然有效！以后我会继续用这种方法来背书。 𐟌 生物化学方面，我学到了DNA复制的详细过程： DNA复制的起始：DNAa蛋白在4个9bp的起始位点上结合，形成DNA-蛋白质复合体，引入张力，促使DNA继续结合在13个3bp位点上。 DNAB蛋白在DNAC蛋白的辅助下结合在DNA解开的一小段链上，然后朝着解旋方向移动，直至解旋出足够进行复制的长度。 DNA解旋是一个高速的反向螺旋过程，必然引起下游的打结，这时需要DNA拓扑异构酶II来切开打结或未打结的部位，并牵引DNA穿过切口进行旋转，再将DNA连接起来。 SSB蛋白结合在已经解开的单链上，防止DNA再次变成双螺旋结构。引物酶和DNAB、DNAC结合形成引发体，朝着5-3方向移动进行复制，由RNA形成的引物的3-OH成为结合位点，dNTP在DNA聚合酶III的作用下形成3.5-磷酸二酯键，以后的dNTP逐步加入。 𐟔„ DNA的延长：DNA双螺旋解开后，一条链沿着解旋方向几乎不间断的复制，而另一条链则需要等待DNA解旋到足够复制的长度才开始有间断的复制。RNA水解酶将引物水解之后，这些空位上会通过DNA聚合酶的作用下互补添上碱基，这些DNA片段成为冈崎片段，DNA连接酶会将这些冈崎片段连接在一起形成一条完整的链。 𐟔š DNA复制的终止：Tus蛋白结合在ter位点时，复制终止。 𐟒堦œ‰机化学方面，我发现了端炔烃在不同溶液中的反应：端炔烃在银氨溶液中生成白色沉淀，在铜氨溶液中生成红棕色沉淀。端炔烃在高锰酸钾的酸性溶液中反应有一个H生成二氧化碳和水，没有氢生成羧酸。端炔可以发生聚合反应。 𐟓 今天的学习让我对生物化学和有机化学有了更深入的理解，期待明天继续探索更多知识！

- 构建表达载体是分子生物学实验中的重要一步，以下是详细的步骤和注意事项：第一步：克隆目的基因 𐟧슩斥…ˆ，你需要克隆目的基因。虽然PCR反应看起来很简单，但很多人都会在这一步遇到问题。你的模板可能是质粒、cDNA或基因组DNA。PCR的结果取决于你使用的每个成分。首先，确保使用高保真酶，这样可以获得保真性强的基因。其次，引物设计要足够特异，长度可以稍长一些，建议一次设计多对引物，因为不一定一次就能成功。第二步：PCR体系与纯化 𐟧𜊥𛺨…ˆ用50的PCR体系，使用大孔胶跑条带并切胶回收。你的目的基因条带必须单一且长度正确，然后进行切胶纯化。不要嫌麻烦，因为这会影响后续连接到克隆载体的步骤。纯化后，别忘了测一下浓度，虽然浓度会比原先低，但问题不大。第三步：连接到克隆载体 𐟔— 将目的基因连接到克隆载体上是很重要的一步。每个实验室使用的克隆试剂盒可能不同，有的用T载，有的用B.zero。按照说明书操作即可。这一步必不可少，因为你的目的基因还没有经过测序，不能直接连接到表达载体上。克隆载体一般使用通用引物，操作方便。很多同学为了省事，直接将目的基因连接到表达载体上，这样后续可能会出现问题。第四步：转化大肠杆菌 𐟦 转化大肠杆菌是一个常规操作。市面上有很多品牌的大肠杆菌感受态细胞。使用时必须严格按照说明书操作，避免反复冻融。刚刚好融化时加入载体转化效率最高。第五步：筛选阳性克隆 𐟔 筛选阳性克隆是常规操作，具体步骤不再赘述。第六步：测序验证 𐟓Š 将提取的质粒进行PCR并送去测序，看看是否与你的目的基因相符。即使长度一致，也不一定是你想要的基因。第七步：连接到表达载体 𐟚€ 最后一步是将目的基因从克隆载体上PCR下来，连接到表达载体上。表达载体的种类很多，取决于你想转化的宿主细胞类型，有真核的、原核的、植物的、酵母的等。设计的引物和使用的连接方法有直接关系。最简便的方法是同源重组。如果使用同源重组方法，用同源臂引物PCR克隆载体。表达载体需要提前进行酶切线性化，推荐双酶切线性化，这样连接效率会更高。按照说明书操作即可，后续的转化大肠杆菌等步骤与之前相同。希望这些步骤能帮助你顺利构建表达载体！如果有任何问题，欢迎留言讨论，大家一起进步！