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wb实验步骤权威发布_wb实验步骤详细步骤(2024年11月精准访谈)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：观点更新日期：2024-11-28

wb实验步骤

𐟓Š 2024年最新WB实验步骤全解析！𐟔슧𛏨🇥䚥𙴧š„WB实验探索，我们整理了一份详尽的实验流程。

WB实验全攻略：从样品处理到结果解读 𐟧ꠥꌦ�ꤊ处理样品前的准备将培养皿或培养瓶放在冰上，用冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞。吸干PBS，然后添加适量的冰冷细胞裂解缓冲液（每107细胞/100 mm培养皿/150 cm2培养瓶加入1 ml；每5㗱06细胞/60 mm培养皿/75 cm2培养瓶加入0.5 ml）。用预冷的塑料细胞刮板刮下贴壁细胞，将悬浮细胞液轻柔地转移至预冷微量离心管中。在4℃下持续搅拌30分钟。随后进行超声处理。以探头超声仪为例，设定功率为40W或总功率的40%，进行多次打3秒停3秒的超声处理，每次超声5-10次。超声后，裂解液将变得清澈且不再黏稠。加入Loading缓冲液后进行煮样。注意：跨膜蛋白不宜煮样，直接加入Loading缓冲液；（若使用水浴超声，则适当延长时间，超声30秒至2分钟，全程保持在冰浴环境中）。若无超声仪，可使用带注射器的针头（20G-18G-16G）在冰上多次抽吸，直至裂解液变清澈。解剖样品前的准备使用干净的器械在冰上解剖目标组织。为防止蛋白酶的降解，最好在尽快完成解剖过程。将解剖好的组织放入圆底离心管或Eppendorf管中，立即浸入液氮中进行“速冻”。将样本存储在-80Ⰳ中备用，或者立即放在冰上进行匀浆处理。对于约5 mg的组织，迅速向管中加入约300 裂解液，并使用电动匀浆器匀浆。使用2倍裂解液两次冲洗刀片，每次使用200 ，然后在4℃下（例如将回旋振荡器放入冰箱中）持续振摇2小时。裂解液的体积应根据组织总量来确定；蛋白提取物不宜过于稀释，以免造成蛋白丢失，同时尽量减少样本体积，以便于在凝胶上进行上样。最小浓度为0.1 mg/mL，最佳浓度为1-5 mg/mL。在微型离心机中以4℃和12,000 rpm的速度离心20分钟。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出并转移到新的预冷离心管中，将沉淀废弃。 𐟓 实验注意事项在进行WB实验时，每个步骤都需要仔细操作，以确保实验结果的准确性。希望这篇详细的实验方案能帮助你更好地理解和执行WB实验。

WB实验详细步骤：从零开始到结果解析蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）是一种常用的蛋白质检测技术，广泛应用于分子生物学和生物化学实验中。以下是详细的实验步骤，帮助你从零开始完成WB实验。 𐟧ꠥꌥŽŸ理蛋白免疫印迹技术主要由三部分组成：凝胶电泳、样品印迹和免疫学检测。 1️⃣ 凝胶电泳：首先进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。 2️⃣ 样品印迹：将凝胶中的蛋白质转移到固相支持物上，常用的材料有硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜。转移方法多为电泳转移，分为半干法和湿法，现在多采用湿法。 3️⃣ 免疫学检测：用特异性的抗体检测已经印迹在膜上的相应抗原。免疫检测方法可以是直接的和间接的，现在多用间接免疫酶标法。具体步骤如下：用特异性的第一抗体杂交结合。再用酶标的第二抗体（如碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合。加酶的底物显色，或者通过膜上的颜色或X光底片上曝光的条带来显示抗原的存在。 𐟓 实验步骤准备样品：将待测蛋白质样品进行处理，使其适合进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。进行凝胶电泳：将处理好的样品加入到凝胶中，进行电泳分离。样品印迹：将分离好的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。免疫学检测：用特异性的第一抗体和酶标的第二抗体进行杂交，最后加酶的底物显色。结果解析：观察膜上的颜色或X光底片上的曝光条带，分析实验结果。通过以上步骤，你就可以完成一次WB实验，并得到相应的蛋白质表达水平检测结果。

𐟧엂实验详细步骤大揭秘！𐟔 𐟔젨›‹白质印迹法，也就是我们常说的Western Blot，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中的一大实验利器。它通过特异性抗体，对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行染色，从而分析特定蛋白质在细胞或组织中的表达情况。 𐟓 实验步骤来啦！ 1️⃣ 倒胶、点样、跑胶，让蛋白分离出来。 2️⃣ 夹心转膜结构，把胶上的蛋白转移到膜上。 3️⃣ 一抗孵育、二抗孵育，让抗体与蛋白结合。 4️⃣ 漂洗3次，去除未结合的抗体。 5️⃣ 胶片曝光，让蛋白条带显现出来。 6️⃣ 手动数据评估，解读实验结果。 𐟒ᠥꌥ™覝准备也不能少哦！细胞、冰盒、96孔板、细胞刮板、裂解液、PBS、EP管、酶标仪等等，都是必不可少的。 𐟓Œ 还有一些小技巧要记住： - 最佳蛋白浓度为3-5ug/uL，这样测出来的结果最准确。 - 电泳结束后，电泳槽内的电泳缓冲液可以回收利用，但注意和新缓冲液区分开来。 - 实验结束后，记得及时清理染液、胶、膜等物品，保持实验室的整洁。 𐟎‰ 现在，你是不是对WB实验的详细步骤有了更清晰的了解呢？赶快动手试试吧！

WB实验秘籍！蛋白到SDS-PAGE 𐟓š 实验步骤概览蛋白提取选择和处理样本：首先，你需要了解目标蛋白的特性，这可以通过查阅已发表的文献或使用在线数据库如Uniport、NCBI和BIOGPS来实现。了解蛋白在哪些细胞或组织中表达，以及是否需要特定刺激来增加表达量。蛋白提取技巧：蛋白提取是WB实验的第一步，裂解液的选择、样本破碎方法、温度和变性条件都会影响蛋白提取的成功与否。整个过程需要在冰上进行，以减少高温引起的蛋白降解。如果是磷酸化蛋白检测，提取液中需要加入磷酸酶抑制剂混合物。蛋白浓度测定取少量裂解液进行蛋白质定量分析。常用的蛋白浓度测定方法有凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法和胶体金法。目前，BCA法是最广泛使用的蛋白定量方法。其原理是在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。BCA试剂与Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。制备SDS-PAGE凝胶 SDS-PAGE的目的是根据蛋白质的大小分离蛋白质。SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子洗涤剂，当溶解时，它的分子在很宽的pH范围内形成净负电荷。将SDS添加到蛋白质中使蛋白质变性，并使其具有均匀分布的净负电荷。这就使蛋白质在电泳过程中向正极迁移。 PAGE（聚丙烯酰氨凝胶电泳）是丙烯酰胺单体的聚合物，当这种聚合物形成时，它会变成凝胶，用电将蛋白质拉过凝胶，就会根据蛋白的大小很好地将蛋白分开。凝胶由两种不同的凝胶层组成：上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.8，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.8。根据目标蛋白分子量大小、表达位置和样本数量确定分离胶和浓缩胶浓度、凝胶厚度和数量。通过以上步骤，你就能顺利进行WB实验，并得到准确的结果啦！𐟒ꀀ

丽春红染色配方在WB实验中，选择合适的染色方法至关重要。考马斯亮蓝染色和丽春红染色是两种常用的染色技术，它们各有千秋，适用于不同的实验需求。 𐟔 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色，也称为Bradford法，是一种高灵敏度的蛋白质浓度测定方法。它能够检测低至0.5ug/cm的蛋白质。在SDS-PAGE中，考马斯亮蓝染色可以评估电泳和湿转条件是否合适。具体来说，染色后可以根据胶上条带的位置、形状及条带间的间距来推断蛋白分离情况，从而评估电泳条件及SDS-PAGE的制备情况。然而，考马斯亮蓝染色有一个重要的限制，即染色后不宜进行转膜，因为染色条件可能会影响SDS-PAGE的稳定性。 𐟌ˆ 丽春红染色丽春红染色则常用于评估转膜是否充分。丽春红染料带负电，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时也能与蛋白的非极性区相结合，形成红色的条带。丽春红染色的可逆性使其容易被dd水、PBS等洗脱，且反应快速，一般仅需5-10分钟。在转膜后，丽春红染色可以帮助研究人员分析错误出现在哪一步骤。此外，丽春红染色还能与考马斯亮蓝染色相结合，综合评估转膜条件是否得当。 𐟒ᠥꌤ𜘥Œ–建议在进行WB实验时，建议进行预实验以确定实验步骤的所有时间条件。预实验中，实验条件的确定依赖考马斯亮蓝染色和丽春红染色。这两种染色方法还能帮助实验纠错，有助于研究人员分析错误出现在哪一步骤。 𐟓 总结考马斯亮蓝染色适用于评估电泳和湿转条件，而丽春红染色则常用于评估转膜是否充分。在WB实验中，选择合适的染色方法至关重要，它们能够提供宝贵的实验信息，帮助研究人员优化实验条件，提高实验结果的准确性。

𐟧엂实验的五大步骤解析𐟔 𐟧WB，全称Western Blot，是一种重要的生物化学技术，旨在检测和分析蛋白质。这个过程可以分为五个关键步骤： 1️⃣ 蛋白电泳 𐟒‰ 首先，我们需要通过SDS-PAGE凝胶制备来进行电泳。SDS-PAGE凝胶带负电，能与蛋白质结合，使蛋白质也带负电。在电场作用下，蛋白质根据分子量大小进行迁移。小分子量的蛋白质会聚集在胶的底部，而大分子量的蛋白质则会在胶的顶部。 2️⃣ 转膜 𐟔„ 接下来是转膜步骤，我们将蛋白质从凝胶转移到膜上进行检测。这个过程就像是一个三明治结构：海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫。在电场作用下，带负电的蛋白质会转移到靠近正极的膜上。甲醇的使用有助于蛋白质与SDS分离，并促进蛋白质与膜的更好结合。 3️⃣ 封闭 𐟚늨†œ具有与蛋白质高度亲和的能力，因此在检测前需要封闭其空白结合位点，以防止非特异性结合。这通常通过使用脱脂奶粉或BSA作为封闭buffer来完成。 4️⃣ 加抗体 𐟒‰ 在封闭之后，我们加入一抗，它能够与蛋白质特异性结合。然后，通过洗涤去除未结合的一抗。接下来，我们加入二抗进行检测，二抗是标记过的抗体，它可以与一抗结合并放大检测信号。二抗上通常带有HRP辣根过氧化物酶，当加入酶的底物时，会引发化学发光，使我们能够看到目的条带。 5️⃣ 检测 𐟔슦œ€后一步是检测，我们使用适当的检测方法来观察和分析结果。这通常包括使用荧光显微镜或化学发光检测器来观察和分析蛋白质与抗体的结合情况。通过这五个步骤，我们可以有效地检测和分析蛋白质，为生物化学研究提供重要数据。𐟧𐟔

细胞免疫共沉淀实验（Co-IP）全攻略细胞免疫共沉淀实验（Co-IP）是一种研究细胞内蛋白质相互作用的重要方法。其基本原理是，如果细胞内两种蛋白质（A和B）有直接或间接的相互作用，那么在温和的裂解条件下获得的蛋白样品中加入A蛋白的抗体，可以将A蛋白沉淀下来，与其直接或间接相互作用的B蛋白或C蛋白也会一起被沉淀下来。通过Western blot检测沉淀中是否存在B或C蛋白，可以确定B或C蛋白与A蛋白的相互作用。 𐟔 用途检测A、B蛋白在体内是否相互结合分离与A蛋白相互作用的蛋白复合物 𐟧ꠦ料与仪器【样品和试剂】 293T细胞（以该细胞做转染为例）转染质粒（Flag-A，HA-B） Flag抗体 2㗠loading buffer PBS Flag-beads 1㗠TBST 5㗠SDS loading buffer 蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂A和B RIPA裂解液【实验仪器】磁力架金属浴 RIPA裂解液旋转混合仪 WB实验相关设备 𐟓 实验步骤一、细胞的铺板与转染提前一晚将293T细胞铺板至6cm皿中，铺板量以达到相应的转染试剂要求为准；用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染2皿细胞：Flag空载+HA-B；Flag-A+HA-B；每质粒2微克。二、免疫沉淀转染24小时后，收获细胞，每皿加入500裂解液，收集细胞至1.5mL EP管中，在冰上超声破碎细胞；超声好后，4℃，12,000g，离心30分钟，取400上清液用于免疫沉淀，80上清用作总蛋白并加入等体积的2㗠loading buffer；将400上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中，加入0.3-0.5 Flag抗体，4℃孵育3-4小时； 4℃，2,000g，离心3分钟，去除未结合的液体，留下beads沉淀，用预冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次，每次5分钟；最后一次去除清洗液，往沉淀中加入602㗬oading buffer，和总蛋白一起在沸水中煮沸15分钟。三、Western Blot检测通过SDS-PAGE分离样品，利用全蛋白样品作为对照，检测Flag-A和HA-B蛋白是否发生结合。 ⚠️ 注意事项对于内源的Co-IP检测应该用10cm皿来培养目的细胞，并维持较好的生长状态；如果该实验用于新蛋白的鉴定，应注意抗体重链和轻链的影响；该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。

WB实验全攻略：科研新手的详细步骤指南 𐟌𑠦”𖩛†细胞（适用于贴壁和悬浮细胞）首先，选择生长状态良好的细胞，移除培养基。然后，加入2ml预冷的PBS进行清洗，重复两次。对于贴壁细胞，加入适量的胰酶进行消化，消化完成后加入完全培养基终止消化，收集细胞悬液。悬浮细胞则直接离心收集细胞沉淀。离心1400rpm 4min，收集细胞沉淀。然后，加入PBS进行清洗，离心1400rpm 4min，重复两次。去除残余的培养基，保留细胞沉淀。将收集的细胞沉淀加入RIPA（强）裂解液中，裂解液需提前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（比例为1：100），冰上裂解10—20min。裂解完成后，高速离心，4℃，12000rpm/10min。收集上清液，转移至1.5ml EP管中，可分装保存于-20℃或-80℃中备用。整个过程需在冰上进行。通过以上步骤，你可以成功收集到高质量的细胞样品，为后续的WB实验打下基础。𐟔쀀

WB实验背景脏？6个步骤教你解决！在进行WB（Western Blot）实验时，背景脏是一个常见的问题。𐟘“ 明明跑出了想要的趋势，但背景却一团糟，这该如何解决呢？其实，背景脏并不一定是因为仪器不干净，也可能是蛋白降解或者实验条件不合适导致的。以下是一些可能出错的关键步骤，以及如何避免这些问题的建议：实验准备首先，确保所有用于提取蛋白的研磨器材、制胶的玻璃板和梳子都清洗干净。如果这些器材长时间不使用，建议在使用前再次清洗，以杜绝污染。提取蛋白选择合适的蛋白裂解液，这样可以去除一些干扰因素，如核酸、多糖和脂类等。蛋白在测量浓度后应变性分装保存，避免反复冻融导致蛋白降解。此外，确保Loading buffer在保质期内，并在加入蛋白后充分混匀，再煮沸变性。制胶在制胶过程中，玻璃板夹紧后，有些人习惯性加水测试是否漏胶。建议用蒸馏水而不是自来水测试，测试结束后要将玻璃板之间的水倒干净，用滤纸吸干残留的水。灌胶前要将配好的试剂充分混匀，灌胶时要掌握好速度，缓慢加入，避免产生气泡。灌注好分离胶后，缓缓加入无水乙醇封胶，速度一定要慢，防止胶面被冲变形。温度较高时，30分钟左右就会凝固；冬天气温较低可能需要较长时间。若分离胶液面不平，会影响后期蛋白电泳的效果。转膜转膜前需在转膜板两侧各放置3至4张滤纸（两侧数量相同）。切记不要用手直接接触PVDF膜和滤纸，手上的油脂会对其造成污染，务必佩戴干净的手套，全程尽量使用镊子夹取。转膜过程中海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵每一层的气泡要排空。转膜时要使整个电转仪置于冰水混合物中，常用220V或者其他高电压进行。机器温度升高会使蛋白降解，导致转膜后条带跑糊，发光后条带和背景也会脏得一塌糊涂。孵育抗体孵育一抗的时间大多选择4℃过夜，也可以室温封闭2小时。4℃过夜效果会比室温好。二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育1到2小时。抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。发光液配置大部分实验室使用的ECL发光液，A液和B液按照1:1的比例配置。发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量。发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。通过以上步骤，可以有效解决WB实验背景脏的问题，让你的实验结果更加清晰准确！𐟒ꀀ

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