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质粒转化最新视觉报道_质粒转化步骤(2024年11月全程跟踪)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：热点更新日期：2024-11-29

质粒转化

𐟔젦„Ÿ受态细胞的多样性选择与使用指南 𐟓– 感受态细胞1.1每支来自喀斯玛锐竞，提供100/支，适用于多种菌种，包括DH5€Top10、JM109、Stbl3和BL21等。选择合适的感受态细胞对于基因克隆实验至关重要，以下是详细的使用感受和步骤： 𐟔 选择适宜的感受态细胞：根据序列的结构、长度、载体种类以及特殊要求等，选择合适的感受态细胞。例如，DH5’ŒTOP10适用于蓝白斑筛选、高效克隆和质粒抽提；JM109是甲基化酶缺陷型；DH10B适用于文库构建、长片段质粒克隆和150bp质粒转化；Stbl3适用于克隆不稳定插入片段、正向重复和逆转录病毒序列；Stbl4则适用于克隆甲基化基因组序列。 𐟔砥“转化实验步骤：取100冰上融化的感受态细胞，加入目的DNA（质粒或连接产物），轻轻混匀后冰上静置30分钟。将混合物在42℃水浴中热激45-60秒，迅速转移至冰浴中，静置2分钟。注意在冰上静置过程中不要晃动样品，以免降低转化效率。向离心管中加入700不含抗生素的无菌液体培养基（SOB或LB），混匀后37℃、200rpm复苏60分钟。根据实验需要，取合适体积的复苏液均匀涂布到含相应抗生素的SOB或LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。通过以上步骤，您可以选择合适的感受态细胞进行基因克隆实验，确保实验的成功和准确性。

质粒转化全攻略：关键步骤与注意事项 1. 从-80℃和-20℃分别取出感受态细胞和质粒，置于冰上解冻。 𐟒™ 若质粒为冻干粉末，可用无菌水或TE buffer稀释至100ng/ul。 𐟒™ 感受态细胞刚溶解时转化效率最佳，建议不超过3分钟。 2. 取1-10ul质粒，轻轻加入到感受态细胞中，轻拍管底或用枪头轻轻搅拌混匀。 𐟒™ 注意不要吸打，以免损伤感受态细胞。 𐟒™ 质粒体积小于感受态细胞体积的1/10。 3. 在冰上孵育30分钟。 𐟒™ 目的是克服质粒和感受态细胞表面的负电排斥作用，使质粒吸附到感受态表面。 𐟒™ 此时可预热水浴锅。 4. 42℃热激45秒。 𐟒™ 时间不要过长，温度不要过高。 𐟒™ 目的是使细胞膜上打开孔隙，让质粒进入细胞。 5. 迅速冰上放置2分钟。 𐟒™ 注意不要晃动。 𐟒™ 目的是使打开的孔隙关闭。 6. 加入700ul左右不含抗生素的LB，37℃，220rpm振荡1小时。 𐟒™ 时间可根据质粒转化效率适当调整。 𐟒™ 盖子不要拧太紧。 7. 5000rpm离心5分钟，弃去部分上清，剩余约200ul上清重悬菌体，取10ul或全部涂布于平板。 𐟒™ 可用一次性无菌涂布棒，减少污染。 𐟒™ 如果质粒转化效率高，或不要求菌体数量，可不离心直接取50-200ul涂布。 8. 37℃或室温静置至菌液被吸收，然后倒置过夜培养（37℃，12-16小时）。 𐟒™ 不要超过16小时。最佳时间为12-14小时，时间太长可能出现卫星菌落。 𐟒™ 次日可挑大且圆润的单菌落摇菌进行后续实验。

𐟧전H5ˆ𖥤‡的魔法原理 𐟔 想要了解DH5ˆ𖥤‡的神奇原理吗？那就跟我一起来探索吧！ 𐟌𑠥œ谢„ƒ的条件下，利用钙离子作为媒介，大肠杆菌在CaCl₂低渗溶液中会膨胀成球形，细胞膜的通透性也会因此增加。 𐟒𜠨𝬥Œ–混合物中的质粒DNA与钙离子携手，形成一种坚韧的羟基-钙磷酸复合物，这个复合物能粘附在细菌细胞表面，大大提高了DNA进入细胞的几率。 𐟔堦Ž夸‹来，通过42℃的短暂热击处理，可以促进细胞对DNA复合物的吸收，让转化更加高效。 𐟌᯸ 热击后，感受态细胞被放入无抗性的液体培养基中，在37℃下孵育和复苏。这样，转入的外源DNA所携带的筛选标记等基因就能得以表达，产生抗性，比如对氨苄青霉素的抗性。 𐟎‰ 最后，将复苏后的大肠杆菌涂布在带有抗性的固体筛选培养基平板上进行筛选，就能得到我们心仪的DH5•毼 ✨ 通过这个过程，我们可以制备出转化率高达5㗱06～2㗱07转化子/质粒DNA的DH5„Ÿ受态细胞，满足各种基因克隆试验的需求。 𐟒ᠦ˜露是觉得这个过程既神奇又有趣呢？那就赶快试试吧！

𐟧쨴觲’转化操作全攻略𐟒‰ 𐟔쥮ž验步骤大揭秘： 1️⃣ 将感受态细胞放置在冰盒上解冻，同时准备好质粒和EP管。 2️⃣ 解冻后，取50感受态细胞加入EP管，再加入0.5-1质粒，冰浴30分钟。 3️⃣ 水浴锅42℃热激60秒，继续冰浴5分钟。 4️⃣ 在超净台内加入500无抗性LB液体培养基，摇床37℃、180rpm孵育15-30分钟。 5️⃣ 离心后去上清，剩余部分轻轻混匀。 6️⃣ 涂板，标记好平板后，取10-20液体涂板，倒置37℃培养过夜。 7️⃣ 第二天观察菌落，合格后封存于4℃。 8️⃣ 挑取单克隆菌落，放入氨苄抗性LB液体培养基中，摇床培养过夜。 9️⃣ 使用试剂盒抽质粒，根据说明书操作。 𐟌Ÿ经验分享时刻： - 感受态细胞-80℃保存，转化前冰上融化。 - 摇床孵育时间根据质粒情况调整。 - 培养基抗生素选择需仔细阅读说明书。 - 涂板量可自行调整，普通质粒可取30涂6cm平板。 - 培养时间一般过夜即可，菌落大小适中时挑菌。 - 提质粒前测OD600值估算细菌浓度。 - 转化前务必阅读质粒说明书，选择合适感受态细胞。 𐟒ᥰ贴士：实验过程中注意无菌操作，确保实验结果准确可靠哦！

影响根癌农杆菌介导香蕉胚性悬浮细胞遗传转化的因素都有哪些？ ? 前言 ? 目前国内外就香蕉的遗传转化开展了一定的工作,通过基因枪法或根癌农杆菌介导法获得了少数几个香蕉品种转基因植株,但由于香蕉单细胞起源的高效再生体系非常难以建立,导致基因工程在香蕉上取得的成功非常有限。 ? 我国学者前期以分化芽茎尖和茎尖薄切片等组织为转化受体探讨了早期遗传转化参数和再生的研究，但该再生途径为多细胞起源,得到的转基因植株多为嵌合体,在筛选的过程中容易出现性状的丢失。 ? 农杆菌菌株与质粒 ? 根癌农杆菌菌株为EHA105,植物表达载体 pCAMBIA1301,含有葡萄糖苷酸酶基因(GUS)和潮霉素抗性基因(HYG)。取菌液接种于YEP+Kan 50 mg/L的培养基中, 在28℃、220 r/min条件下振荡培养至D600 nm为0.8～ 1.0。 ? 将培养好的菌液在4℃、5 000 r/min条件下离心 5 min,弃上清,用农杆菌液体培养基洗涤1次,再加入重悬液用于转化。 ? 培养基及培养条件 ? 胚性细胞悬浮培养基MS基本培养基+ 1 mg/L 2,4-D+1 mg/L生物素+100 mg/L谷氨酰胺 +100 mg/L麦芽提取物+45 g/L蔗糖,p H 5.3。 1.4.2重悬菌液培养基MS液体培养基+AS(ace tosyringone)100ol/L。 ? SH培养基中的大量元素和微量元素及其铁盐+ MS维生素+1 mg/L生物素+100 mg/L谷氨酰胺+ 230 mg/L脯氨酸+100 mg/L麦芽提取物+1 mg/L NAA+0.05 mg/L玉米素+108/L Kinetin+0.2 mg/L 2-ip+10 g/L乳糖+45 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉+AS (acetosyringone)100ol/L,pH 5.8。 ? 以上培养基均在121℃条件下灭菌15 min,悬浮培养,体胚的诱导和成熟在(28ⱱ)℃、黑暗条件下进行。胚性细胞悬浮培养保持在持续110 r/min 的旋转摇床上进行。 ? 菌液浓度对根癌农杆菌转化的影响 ? 大量实验证明,农杆菌菌液的浓度和农杆菌细胞的生长状态是转化成功的关键因素,为此,我们采用处于对数期的农杆菌来进行香蕉胚性细胞的遗传转化因素的探讨。 ? 根据图中得知，农杆菌菌液浓度在D6 00 nm0.2时,瞬时表达率最高为13.42%。随着D6 00 nm值的升高,瞬时表达率反而降低。当菌液浓度达到D6 00 nm1.0时,瞬时表达率下降至3.06%。 ? 可见农杆菌菌液浓度对香蕉胚性细胞的转化具有重要影响。如果农杆菌菌液浓度过高,菌体自身容易聚合在一起而不利于外源基因的介导,并且会造成大量细胞的褐化死亡。 ? 当菌液浓度比较低时,转化效果比较好,可能是因为悬浮细胞表面能够和根癌农杆菌菌体相结合的敏感部位比较多,从而在低浓度时就可以进行较高的瞬时表达。 ? 共培养时间对根癌农杆菌转化的影响 ? 农杆菌和外植体的共培养在整个转化过程中是非常重要的环节,因为农杆菌附着、T-DNA的转移及整合都在共培养时间内完成。香蕉悬浮细胞与农杆菌共培养1、2、3、4 d后均没有检测到GUS的瞬时表达,在第5天时开始出现GUS的瞬时表达。 ? 到第8天时,瞬时表达率最高,达20.73%。第9天后开始显著降低。因为农杆菌的过度生长抑制了植物细胞的生长,导致转化的瞬时表达率下降。 ? 侵染时间对根癌农杆菌转化的影响 ? 农杆菌菌液和悬浮细胞分别侵染10、20、30、40 min的瞬时表达率,当侵染时间为10 min时,瞬时表达率最高为25.30%。随着侵染时间延长至40 min时,瞬时表达率下降为10%左右。 ? 可能是因为细胞在菌液中浸泡时间过长,农杆菌毒害而使细胞缺氧,造成瞬时表达率下降。另外,还会引起共培养阶段农杆菌的过度生长,难以用抗生素来抑制,导致细胞变褐死亡。 ? ?结论 ? 综上所述，处于对数期的贡蕉悬浮细胞作为转化受体, 根癌农杆菌浓度D6 00 nm为0.2时,与悬浮细胞进行侵染,在室温、8 000 r/min离心5 min,然后在110 r/min的旋转摇床上摇5 min,在体细胞胚诱导培养基上共培养8 d,瞬时表达率达可以达到最高值 25.30%。

𐟔즞„建质粒载体的详细指南𐟧슰ŸŒˆ质粒载体的选择：首先，选择一个具备合适限制性酶切位点的质粒载体，这些位点将用于将插入片段整合到多克隆位点中。确保插入片段中不存在这些酶切位点，以避免片段被切开。 𐟌ˆ获取插入片段：DNA可以通过提取任何细胞或组织样品获得，或者通过PCR扩增。 𐟌ˆ酶切反应：扩增完成后，使用限制性内切酶对片段和载体进行酶切。 𐟌ˆ纯化质粒和片段：酶切后，通过电泳分离片段和载体，并使用凝胶纯化回收它们。 𐟌ˆ连接DNA片段：使用DNA连接酶将插入片段连接到质粒中。连接反应中，插入片段与载体的最佳比例为3:1，以确保少量载体自连。连接反应可以在14-25℃下孵育1小时或过夜。 𐟌ˆ转化细菌：通过热激法将连接后的质粒转化到细菌中，并将转化后的细菌涂抹在含有抗生素的琼脂板上，在37℃环境中培养过夜。由于质粒包含抗生素抗性基因，成功转化的细菌在抗生素存在下会生长形成菌落。 𐟌ˆ筛选克隆：从转化板中挑选多个单克隆，接种到含有培养基且已编号的管中，在摇床培养箱中进行扩增，并纯化质粒。 𐟌ˆ鉴定质粒：使用限制性酶切割质粒，并将酶切产物进行凝胶电泳，以检查插入片段的存在。证实转化了插入片段的质粒可用于扩大培养和测序。 𐟑颀𐟔쥜覕𔤸꨿‡程中，每个步骤都需要严格控制条件和操作规范，否则可能导致失败。只要按照这个流程认真操作，相信大家都能成功构建质粒载体！

国产电穿孔仪：电穿孔法于细菌质粒转化的关键应用及成效

大肠杆菌的7种神奇用途，你知道几个？ 1. 𐟧전H5a菌株 DH5a菌株是质粒克隆的常用菌株。当使用pUC系列质粒载体转化时，DH5a与载体编码的半乳糖苷酶氨基端实现互补，从而用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 𐟔砂L21(DE3) 菌株 BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于™쨏Œ体DE3区，该区整合于BL21的染色体上，适合表达非毒性蛋白。 𐟛᯸ BL21(DE3) pLysS菌株 BL21(DE3) pLysS菌株含有质粒pLysS，具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达，适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 𐟔 JM109菌株 JM109菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZ15进行互补，从而显示半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。 𐟓ˆ TOP10菌株 TOP10菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝。 𐟌𑠈B101菌株 HB101菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验。 ⚙️ JM110或 SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响，部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。

哪些实验必须测量DNA浓度？𐟧찟”슥œ觔Ÿ物学和分子生物学研究中，测量DNA浓度是许多实验的关键步骤。你知道哪些实验类型需要测DNA浓度吗？让我们一起来看看吧！ PCR产物的纯化 𐟧슥𝓤𝠥ˆ了一次PCR实验后，通常需要测定扩增产物的浓度，以评估PCR的效率和为后续实验做准备。通常，1个吸光度值（A260）相当于50/ml的双链DNA，或者40/ml的单链DNA或RNA。酶切产物的精确计算 𐟔ꊥœ襈†子克隆实验中，酶切后的DNA片段需要测定浓度，以便进行后续的克隆、测序或其他分析。通过测定A260，你可以得到精确的浓度，为接下来的实验做好准备。质粒提取后的确认 𐟒𞊦取质粒后需要测定其浓度，以确保有足够的质粒用于转化、转染或其他分子生物学应用。基因组DNA提取的质量检查 𐟔 你刚刚从样本中提取了基因组DNA，现在需要评估提取的质量。A260/A280比值大于1.7表示你的DNA纯度很高，没有蛋白质污染。 DNA合成的精确度量 𐟓 你合成了一段DNA，需要知道它的确切浓度。这不仅关系到后续实验的准确性，也关系到你的研究成果的可靠性。构建文库的必备步骤 𐟓š 无论是基因组文库还是cDNA文库，DNA浓度的测定都是构建成功文库的关键。基因组编辑的精细调控 ✂ CRISPR-Cas9等技术需要精确的DNA浓度来优化实验条件，确保基因编辑的成功率。 DNA疫苗的质量控制 𐟒‰ 在开发DNA疫苗时，准确的DNA浓度测定对于确保疫苗的剂量和效果至关重要。这些实验都需要精确的DNA浓度测定，以确保实验的准确性和可靠性。希望这篇文章能帮助你更好地理解DNA浓度测定的重要性！

QuikChange法突变，详解！ QuikChange法适用于点突变（或相邻多个位点突变）、基因删除、小片段基因插入或替换。虽然其他步骤相同，但引物设计略有差异。以下是详细原理和操作方法：简要原理 𐟓œ QuikChange法相当于对整个质粒进行PCR（环P）。利用带有反向互补序列的引物，将整个质粒进行PCR扩增。PCR过程中，质粒形成环状，转化大肠杆菌后缺口被修补。实验方法 𐟧ꊤ𛥥Œ链质粒为模板进行PCR扩增（PCR退火温度根据引物确定，延伸时间根据整个质粒长度及DNA聚合酶确定）。模板量可以减少到1-5ng/50，循环数可减少至25-28个。 PCR条件示例 𐟔効5℃，5min，1循环 95℃，30s 60℃，30s 72℃，4min，25循环 72℃，10min，1循环 PCR后最好先跑胶确认有没有条带。虽然有很多人说PCR后没有条带也正常，转化依然可以长出菌落，但个人经验：如果无条带或者条带弥散，转化大概率不会长。 Dpn酶切 𐟔ꊦ‰饢ž产物用Dpn酶切去除甲基化的质粒模板。Dpn酶切条件示例： 10㗢uffer：2 DpnI：1 37℃孵育2小时。转化与验证 𐟧슥𐆩…𖥈‡后的产物转化DH5a/Top10感受态细胞，进行菌落PCR和测序验证。详细原理 𐟔스𛥨𔨧𒒄NA作为模板，在高保真聚合酶作用下，使用两条具有同源序列的引物引导DNA合成。两条引物内均含有预定突变位点，经过多轮热循环，双链质粒DNA的全长均以线性形式扩增。由于引物含有同源序列，最终产生DNA双链带交错缺口的突变质粒。经过高保真酶扩增而得到的DNA产物具有缺口，DNA链的磷酸二酯键并未闭合，非闭合环形质粒同样也能被大肠杆菌细胞吸收，断裂的缺口可在质粒进入感受态细胞内后被修补。甲基化修饰 𐟧ꊥŽŸ来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpnl敏感而被切开（Dpnl识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次）。而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。通过以上步骤，你就可以成功设计并操作QuikChange法突变引物啦！

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