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qpcr引物设计新上映_qpcr引物设计原则(2024年11月抢先看)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：导读更新日期：2024-11-27

qpcr引物设计

如何设计qPCR引物：实用指南大家好！今天我们来聊聊如何设计qPCR（定量PCR）的引物。其实，qPCR的引物设计和普通PCR差别不大，都可以用NCBI来方便地设计。不过，由于qPCR鉴定的是mRNA的表达，所以在设计引物时需要特别注意以下几点：第一步：打开NCBI 首先，打开NCBI（美国国立生物技术信息中心）网站，搜索你需要的基因（例如Lepr）。第二步：找到基因卡片点开基因卡片，找到最下方的mRNA和Protein描述。根据你的需求选择合适的Isoform，然后复制NM码。第三步：进入引物设计页面在NCBI的引物设计（Primer design）栏目输入刚才复制的NM码。我个人更喜欢下载cDNA文件，然后用SnapGene手动拉取引物，这样可以直接看到cDNA序列，更加直观。第四步：确认引物CG值在SnapGene中确认引物的CG值（大约50%），Tm值在60度左右。可以多设计几对引物，以防有些引子不工作。希望这些小技巧能帮到大家，祝科研顺利！𐟒ꀀ

多重PCR引物探针设计：从基础到实践多重PCR在科研实验中应用广泛，能够显著节省实验时间。然而，多重PCR和多重qPCR的引物探针设计却是一个复杂的过程。设计过程中的关键步骤和考虑因素如下： 𐟔 特异性要求高：引物和探针需要与目标序列精确匹配，以确保只扩增或检测特定的DNA或RNA片段。这要求在设计过程中仔细选择序列，避免与目标序列之外的其他序列产生非特异性结合。此外，引物探针的GC含量、二级结构等因素也会影响其稳定性。 𐟓 设计原则复杂：引物和探针的设计需要遵循一系列原则，包括长度、GC含量、Tm值、避免连续相同碱基等。这些原则需要根据具体的实验条件和目标序列进行调整，以确保引物和探针的性能，另外也需要考虑合成的难度等问题。多重PCR和多重qPCR的引物探针设计是一个需要仔细规划和执行的过程，确保实验结果的准确性和可靠性。

𐟔젒T-PCR实验全攻略：从原理到实践 𐟓š 目录 cDNA与反转录 RT-PCR原理与目的 RNA抽提与质量检测反转录过程 PCR程序与引物设计 PCR酶与体系 PCR产物检测实时荧光定量PCR（RT-qPCR）常见问题与注意事项 𐟔젣DNA与反转录 cDNA（互补DNA）：与RNA链互补的单链DNA。在适当引物的存在下，由DNA聚合酶即反转录酶合成的单链DNA就是cDNA。反转录（Reverse Transcription）：在反转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA的过程。合成的DNA链称为与RNA互补的DNA，即cDNA。 𐟔젒T-PCR原理与目的原理：RT-PCR全称反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction），将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。目的：检测核酸的表达，主要是RNA的表达。DNA不需要反转录的过程，直接PCR检测即可。 𐟔젒NA抽提与质量检测 RNA抽提方法：TRIzol法。主要成分包括苯酚，用于裂解细胞和变性蛋白。 RNA质量检测：分光光度计测定、凝胶电泳法。 𐟔젥转录过程以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中，遗传信息的流动方向与转录时相反，因此称为“反转录”。需要反转录酶，合成的DNA称为与RNA互补的DNA（cDNA）。根据不同情况选择不同的反转录引物。 𐟔점CR程序与引物设计 PCR程序：三步法，包括变性、退火和延伸三个基本反应。引物设计：找到目的基因的CDS序列，用软件设计和评价引物，并使用BLAST进行引物特异性检测。引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作；3'-端的Tm值要低于5'端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。 𐟔점CR酶与体系 PCR酶：可选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。 PCR体系：按所选的PCR酶说明书来配制。 𐟔점CR产物检测一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 𐟔젥—𖨍祅‰定量PCR（RT-qPCR）基本原理：在PCR体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过对PCR过程中产生的荧光信号累积或荧光标记的特异性探针释放的荧光信号进行监测和记录，实时监测整个PCR进程，再结合软件对获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品中特定DNA片段的初始量。扩增过程：包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。常见问题与注意事项：在进行RT-PCR实验时，需要注意实验条件的选择、引物的设计、RNA的质量控制以及实验操作的规范性等问题，以确保实验结果的准确性和可靠性。

拟南芥突变体鉴定三引物法 𐟌𑤻妋Ÿ南芥（Arabidopsis thaliana）的ACD5基因为例，我们来学习如何使用Primer3 Plus设计引物吧！ 1️⃣ 首先，登录Ensembl plant数据库，选择拟南芥作为物种，并输入ACD5基因，点击“go”。 2️⃣ 在搜索结果中，点击选中的基因，再选择一个转录本和cDNA。 3️⃣ 点击“Configure this page”，然后显示外显子。 4️⃣ 下载cDNA序列，选择RTF格式，并包含行号。 5️⃣ 下载后，你会看到蓝色部分代表外显子。 6️⃣ 接下来，打开Primer3 Plus，将下载的序列粘贴进去，选择qPCR策略。 7️⃣ 在3’端选择两个外显子的连接处，将后面一个的第一位作为primer overlap position。 8️⃣ 进入“General Settings”，按照引物设计原则设置数值： - S代表上游引物，A代表下游引物。 - tm在58左右，正负2度（55-65），上下游引物Tm差最好不要超过5℃。 - GC%在40%-60%。 - 3’末端不能是A，最好是T。 - 不能有连续3个相同的碱基。 - 3’端一定不能有错配。 - 引物自身和引物之间不能有4个连续的碱基互补。 - 退火温度要适宜，温度高则扩增特异性强，温度低则扩增效率高。 - 引物长度一般在15-30个碱基。 9️⃣ 点击“Pick Primer”，即可获得引物。之后点击“previous”和“Next”查看上下引物，并检查是否有潜在的高级结构如发夹结构和二聚体。 𐟔Ÿ 最后，使用primer blast输入上下游引物，选择正确的库和物种，点击“Get Primer”，查看引物的长度、Tm值、GC含量等分析结果。确保引物不会匹配到同物种或不同物种的其他基因。

5种常见溶解曲线错误及解决方法大家好，今天我们来聊聊荧光定量PCR（qPCR）中常见的五种溶解曲线错误及其解决方法。溶解曲线下滑 𐟓‰ 当溶解曲线的平台期出现得太晚，求导时可能会出错。这通常是因为产物过长或GC含量过高导致的。解决方法是更换引物，避开高GC序列，选择较短产物的引物。宽峰问题 𐟏ž️ 有时你会发现溶解曲线的峰比其他人跑出来的要“胖”，但又是单峰。这其实是宽峰由几个峰叠加形成，出现了与产物TM值相近的非特异性产物。解决办法是重新设计引物，并在NCBI上进行Blast比对，选择特异性好的引物。双峰现象 𐟏”️ 当非特异峰出现在特异峰左侧时，可能是扩增出引物二聚体；当非特异峰出现在特异峰右侧时，则是出现了非特异性产物。解决方法首选重新设计引物，或者降低引物用量，更改实验程序。阴性对照起峰 𐟌꯸ 如果实验结果中发现阴性对照（NTC）起峰，不要慌张，这并不意味着引物不能用。查看实验样品的溶解曲线，如果只有一个产物特异峰，说明引物二聚体会在没有模板时产生，加入模板后，引物二聚体的产生会受到抑制。无溶解曲线 𐟚늦œ‰时你可能发现结果中只有扩增曲线，没有溶解曲线。这可能是因为仪器没有设置溶解曲线的程序。不同仪器的溶解曲线程序可能有所不同，需要手动添加。溶解曲线的原理 𐟌᯸ qPCR程序结束后，将温度升到95℃，DNA开始解链，DNA的小沟区域也逐渐消失，SYBR Green从小沟区域释放出来，荧光信号值开始逐步降低。当温度达到产物解链一半时的温度，即Tm值时，SYBR Green大量游离出来，荧光信号值会突然下降达到0，这就是溶解曲线的来源。原始曲线进行导数分析后，溶解曲线会变成一个峰。了解这些原理后，你就能更快地解决上述问题了。溶解曲线的Tm值是溶解曲线中的重要参数，在使用同一qPCR试剂下，目标基因溶解曲线的Tm值由其产物长度和GC含量决定。只要不改变qPCR试剂，其TM值不会发生改变。因此，如果引物不会扩增出非特异性产物，就只会有一个峰；存在多个非特异性产物时，就会有多峰的情况产生。

𐟔점CR定制服务，提供qPCR检测、PCR代做、QPCR定制、引物设计、RNA提取、逆转录、数值分析等服务。 𐟓Š 提供溶解曲线、扩增曲线、柱状图、CT值等实验数据，保证结果真实可靠。 𐟓‹ 保证数据唯一性，确保实验结果的真实性和准确性。 𐟔砥Œ…括引物设计、RNA提取、逆转录等实验步骤，满足您的定制需求。 𐟓ˆ 提供Amplification Plot和Melt Curve Plot，帮助您更直观地了解实验过程和结果。

荧光定量PCR技术详解：从原理到实践实时荧光定量PCR（qPCR）技术是一种强大的分子生物学工具，它通过荧光染料或标记的特异性探针来追踪PCR产物的积累。随着PCR反应的进行，荧光信号强度与产物量成正比增加。通过收集每个循环的荧光信号，可以绘制出荧光扩增曲线，进而计算待测样品的初始模板量。这项技术广泛应用于DNA和RNA的相对定量、绝对定量和定性分析。 𐟚€ 常见问题解答 1️⃣ 如何选择合适的内参基因？对于常见物种，如mRNA通常使用actin作为内参，而miRNA检测则使用U6。对于特殊物种，建议根据文献选择合适的内参。如果无法确定内参，可以提供内参基因筛选服务，帮助选出稳定的内参。 2️⃣ 引物出现非特异怎么办？可以通过提高退火温度、减少引物量或重新设计引物来解决。 3️⃣ 如何判断扩增曲线是否良好？曲线拐点清晰，特别是低浓度样本的指数期明显。曲线指数期的斜率与扩增率成正比，斜率越大，扩增效率越高。基线平直或略微下降，无明显上扬趋势。各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。 4️⃣ 荧光阈值如何设定？在荧光扩增曲线的指数增长阶段设定一个荧光强度标准（即PCR扩增产物量标准）。荧光阈值可设定在指数扩增阶段的任意位置，但需结合扩增效率、线性回归系数等参数综合考虑。 5️⃣ Ct值是什么？在PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极好的重复性。荧光定量PCR技术相比常规PCR，具有更高的特异性、能有效解决PCR污染问题，且自动化程度高，已广泛应用于分子生物学研究和诊断中。

分子克隆实战指南：PCR篇 𐟔奈†子克隆的目的是构建目的基因重组体，并在细胞中验证其成功过表达。以下是主要流程： 1️⃣ PCR：获取目的基因TP53基因的CDS区（1182bp），通过PCR并经琼脂糖凝胶电泳验证条带，然后胶回收目的基因。 2️⃣ 酶切：将目的基因与载体用特定限制性核酸内切酶切割，暴露粘性末端，并分别胶回收这两部分。 3️⃣ 连接：用DNA连接酶连接暴露粘性末端的目的基因和载体。 4️⃣ 转化：将连接成功的环状产物转化到大肠杆菌感受态细胞。 5️⃣ 涂板：12-16小时后挑菌做菌落PCR验证。 6️⃣ 摇菌：直接摇菌中提（见之前菌落PCR笔记，可以省去小提步骤）。 7️⃣ 提取质粒并测序。 8️⃣ 转染：将质粒转染细胞24小时后（记得要有对照组，即只转染试剂组）。 9️⃣ 提取细胞总RNA。 𐟔Ÿ 逆转录成cDNA。 1️⃣1️⃣ 设计qPCR引物（Primer bank查询即可）。 1️⃣2️⃣ 实时荧光定量PCR检测目的基因TP53。 ⚠️注意事项： 1️⃣ PCR试剂盒选择：实验室之前使用Takara的Primer star高保真酶，后期发现很多国货非常好用，如ATG巨匠生物的ATG 2*Proofast Master Mix，PCR结果稳定，酶高保真且扩增效率高。 2️⃣ PCR程序设定的两个关键问题：退火温度：与引物性质有关，注意设计引物软件中的Tm值不应算上酶切位点和保护碱基，应只含互补配对部分，这时的退火温度才是准确的。理论上一定范围内，退火温度高时，特异性好。所以很多同学碰到有杂带的情况，可以适当提高退火温度；反之，如果条带不出，可以适当降低退火温度。延伸时间：延伸时间与片段长度有关，还与酶的延伸效率有关，可以参见DNA聚合酶的说明书。 3️⃣ 通过胶回收获得的产物是未暴露粘性末端的双链DNA，所以还需要后续的限制性核酸内切酶进行酶切，将载体和目的基因片段都暴露粘性末端，才能进一步连接。

𐟧챭PCR实验问题大揭秘𐟔 𐟔젦 ‡准的qPCR扩增曲线会经历基线、指数和平台期，但实验中可能会遇到各种异常情况。本期将通过案例分析，带你了解常见问题及解决方案！ 𐟒ᠩ—˜1️⃣：无模板控制（NTC）组出现指数扩增？可能是实验室污染或试剂生产过程中的遗留污染。解决方法包括清洁工作区域、确保试剂无污染，并重新制备反应混合物。 𐟓Š 问题2️⃣：早期周期循环数据点记录高噪点？可能是基线调整过早或模板添加过多。建议查看原始数据，调整基线，并确保样品稀释至线性范围内。 𐟎—˜3️⃣：扩增曲线异常、数据不可重复或Cq值晚于预期？可能是PCR反应效率低、引物设计不合理、退火温度过低或模板含有抑制剂。优化引物浓度、退火温度，并重新设计引物。 𐟓ˆ 问题4️⃣：标准曲线斜率或R2值异常？可能是稀释度不准确、标准曲线超出线性范围或数据可变。重新计算标准浓度，制作新控制标准液，并消除极端浓度影响。 𐟏† 问题5️⃣：平台期远低于预期？需结合具体情况分析原因，并采取相应措施。可能是PCR反应效率问题或引物设计不当。 𐟔 通过以上分析，相信你能更好地解决q-PCR实验中的常见问题！记得做好实验记录，为后续分析提供有力支持哦！𐟌Ÿ

qpcr数据作图 1️⃣ 样品纯化与污染控制：确保样品纯净，避免交叉污染。避免在打开EP管盖时产生气溶胶，手套不要触碰管帽内壁，并定期更换手套。扩增前后实验区域分离，不要在扩增前区域打开扩增后的EP管。 2️⃣ 扩增条件优化：调整镁离子浓度、引物设计、模板质量（包括抑制剂）、循环数、缓冲成分、酶浓度以及其他PCR添加剂或增强剂，以获得最佳扩增效果。 3️⃣ PCR体系设置：由于real-time qPCR的灵敏度高，每个样品至少设置3个平行孔，以确保数据分析的准确性。一般使用2㗧š„real-time qPCR MasterMix浓缩液，只需加入模板和引物即可。MasterMix应避免反复冻融，如果频繁使用，最好溶解后放在4℃保存。 4️⃣ 数据分析与统计：确保Ct值差异较小且标准差（SD）不大，以便进行统计分析。 5️⃣ 实验设计与重复：进行实验时，确保每个条件至少重复三次，以提高结果的可靠性。 6️⃣ 引物设计：选择合适的引物序列，确保引物的特异性和效率。 7️⃣ 模板质量：使用高质量的模板DNA，避免抑制剂的存在。 8️⃣ 酶浓度：调整酶浓度，找到最适合的酶量。 9️⃣ 缓冲成分：选择合适的缓冲液成分，以优化PCR反应。 𐟔Ÿ 镁离子浓度：调整镁离子浓度，以获得最佳的PCR反应条件。 1️⃣1️⃣ 循环数：根据实验需求调整循环数，以达到最佳扩增效果。

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