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慢病毒载体前沿信息_慢病毒载体构建及包装流程(2024年12月实时热点)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：教程更新日期：2024-12-03

慢病毒载体

NEJM刊文：这种基因疗法会导致10%的病人患癌！肾上腺脑白质营养不良（ALD）是一种罕见的单基因遗传性脂类代谢病，该病会破坏大脑神经，并常常导致患者在 20 岁之前死亡。2022 年，美国食品和药品管理局（FDA）批准了Bluebird Bio公司的基因疗法 Skysona 。该疗法使用改造过的慢病毒载体递送治疗基因，阻止疾病进展，治疗费用高达 300 万美元。 10月9日，一项发表于《新英格兰医学杂志》（NEJM）的研究报告显示，在接受 Skysona 临床试验的 67 名患者中，6 名患者患上了一种名为骨髓增生异常综合征（MDS，该疾病可以发展为白血病）的恶性肿瘤，一名患者患上了白血病。据悉，早在 2021 年和 2022 年，Skysona 已分别导致一例和两例患者出现 MDS。而在此次患癌的 7 名患者中，6 人不得不再次接受造血干细胞移植以治疗副作用，其中 4 人的癌症已经治愈，一名患者因对移植干细胞的免疫排斥而去世。随着时间推移，患癌病例或还将继续增加。研究人员推测，患者出现癌症可能源于慢病毒载体携带的强力增强子序列激活了致癌基因；另一可能因素是化疗，因为这 7 位患癌病例中的 6 例都曾使用过氟达拉滨（fludarabine）。研究人员正在考虑重新设计可以更精准靶向患病细胞的慢病毒载体，并不再引入强力增强子。「热门微博」「科研动态」「医学进展」「药物」

如何选择合适的感受态细胞？𐟤” 在实验室中，选择合适的感受态细胞至关重要，它们能够影响实验的效率和结果。以下是一些常见的感受态细胞类型及其特点，帮助你做出最佳选择： DH5a 𐟏… DH5a是实验室常用的感受态细胞，转化效率高，特别适合用于蓝白斑筛选。 T0P10 𐟌€ T0P10是常规实验用的克隆感受态细胞，生长速度快，转化效率高，同样适用于蓝白斑筛选。 JM109 𐟔슠 JM109是提取高质量DNA的理想菌株，非常适合用于构建克隆和蓝白斑筛选实验。 Stbl3 𐟌 Stbl3是慢病毒载体系统推荐使用的菌株，适用于特定的实验需求。 DH10B 𐟌 DH10B能够提取高纯度DNA，特别适合克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA。 BL21 𐟒ꊠ BL21用于非毒性蛋白的高水平表达，效果显著，是超级好用的选择。选择合适的感受态细胞可以大大提高实验的效率和成功率，记得根据具体实验需求来选择哦！𐟔찟ŒŸ

𐟧짨𓨽짻†胞系构建全攻略𐟒ኦž„建稳转细胞系，这些方法你必须知道： 1️⃣ 慢病毒法：利用慢病毒载体，将目的基因稳定整合到细胞基因组中。 2️⃣ 转座子法：通过转座子技术，实现目的基因在细胞中的稳定表达。 3️⃣ CRISPRa法：利用CRISPR-a系统，精确编辑细胞基因，达到稳定表达的目的。 4️⃣ Knockin法：通过基因敲入技术，将目的基因插入到细胞基因组特定位置。 𐟤”构建时遇到这些问题怎么办？ ✅ 密码子优化：针对长基因，优化密码子可大幅提升蛋白表达量。 ✅ Kozak序列：真核生物mRNA翻译起始的关键序列，确保蛋白正确翻译。 ✅ 启动子选择：根据细胞类型和基因长度，挑选合适的启动子。 ✅ 培养体系调整：根据细胞代谢需求，调整培养体系，维持细胞最佳生长状态。 ✅ 标签位置选择：根据蛋白特性和纯化需求，合理放置标签。 𐟚릳覄：不建议构建稳转敲除的细胞系，以避免脱靶效应对细胞状态的影响。遵循这些步骤，你的稳转细胞系构建将更加高效与精准！✨

11/27，美国FDA已对bluebird bio的基因疗法Skysona（elivaldogene autotemcel）展开调查，该疗法于2022年获得批准，用于治疗4至17岁男孩的脑性肾上腺白质营养不良症（CALD）。调查背景此举源于上个月《新英格兰医学杂志》（NEJM）发布的一篇论文，揭示了67名接受该疗法治疗的儿童中，有7名在治疗后14至92个月之间发生了血液系统恶性肿瘤。报告指出，7名患者中有1例急性髓性白血病（AML），以及6例骨髓增生异常综合症（MDS）。这些患者参与了两项24个月的研究和一项长期随访研究。 FDA考虑采取监管行动 FDA周三表示：“FDA正在调查与Skysona治疗相关的血液系统恶性肿瘤的已知风险，这些恶性肿瘤可能导致严重后果，包括住院、需要同种异体造血干细胞移植（HSCT）和死亡，并正在评估是否需要采取进一步的监管措施。” FDA还建议：“鉴于这一风险，医疗服务提供者应谨慎考虑替代治疗方案，包括对于具有合适、愿意并可用的HLA配型捐献者的患者，考虑使用同种异体造血干细胞移植，而不是立即决定用Skysona治疗儿童。” 慢病毒载体插入与患者情况根据NEJM的论文，6名有数据的患者显示其DNA中有多个位置出现了慢病毒载体插入。5名患者的插入位点接近MECOM-EVI1基因，1名患者的插入位点接近PRDM16基因。部分患者出现了细胞减少症，大多数患者的载体插入发生在同一克隆内的多个基因中。截至今年4月，5名患者已接受同种异体HSCT治疗MDS或AML，其中4名患者存活，1名患者因移植物抗宿主病去世。 Skysona的现有风险警告与后续研究 Skysona在美国的标签中已包含关于治疗后发生血液恶性肿瘤的严重风险的黑框警告。此外，批准还要求进行为期15年的上市后安全性研究。在批准之前，Skysona已经因2021年在一项III期临床试验中出现疑似MDS病例而受到FDA临床暂停。公司面临财务挑战 bluebird bio目前面临持续的财务挑战，最近披露公司仍处于财务困境中。在第三季度财报发布时，公司表示，若无法获得额外资金，预计到2025年初将耗尽现金储备。9月，bluebird宣布将裁员约四分之一，以期将运营成本减少20%。同时，Skysona与该公司三款基因疗法（Lyfgenia [lovotibeglogene autotemcel]和Zynteglo [betibeglogene autotemcel]）一直未能获得市场认可。网页链接

我所有课题的sponsor，Vyriad公司今天宣布了和诺华公司的战略合作以加速临床转化用重靶向的慢病毒实现在体CAR-T疗法。CAR-T疗法最近又爆发了第二春，但目前还是依赖于从病人体内分离T细胞再在体外用病毒载体转化为CAR- T细胞再体外扩增最后会输病人体内。这种方法既贵又费时。而Vyriad公司的重靶向慢病毒可直接输入患者直接在体实现CAR-T疗法，具有不可比较的优势。这次输血降大大加速临床转化。对我的一个研究项目用疱疹病毒载体实现在体CAR- T疗法也有很大促进作用。 Vyriad公司致力于用病毒载体实现在体的免疫疗法、细胞疗法和基因治疗。

尼帕病毒包膜，CAR-T新策略！在In vivo CAR-T疗法的研究中，科学家们发现了一种独特的方法来改造和递送CAR-T细胞。他们利用尼帕病毒的包膜来进行改造，因为尼帕病毒的包膜具有独特的靶向区域和膜融合区域，这两个区域在病毒包装过程中需要分别在两个质粒中进行。基本策略是通过突变尼帕病毒的靶向区域，并添加DARPin来靶向T细胞。DARPin是一种人工设计的蛋白质，能够特异性地结合到目标细胞上。在这个研究中，DARPin被设计成靶向CD4+或CD8+ T细胞。利用假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体（如慢病毒样颗粒或慢病毒载体），科学家们可以选择性地调节免疫细胞的不同亚型的活性。这些假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体携带细胞特异性靶向结构域（如特异于CD4+ T细胞或CD8+ T细胞）和功能结构域（如细胞因子）。与仅包含细胞特异性靶向结构域的相应颗粒或载体相比，将功能结构域与假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体上的细胞特异性靶向结构域结合，极大地改善了免疫细胞的靶亚型的选择性活性调节。例如，研究人员发现，呈现刺激性细胞因子的T细胞靶向颗粒在细胞类型混合培养物中和在体内人血液系统小鼠模型中选择性地激活靶T细胞亚群，并且还将包装的基因递送到靶T细胞亚型中，而无需任何刺激性培养条件。基于MeV（麻疹病毒）糖蛋白的呈现IL-7（白细胞介素-7）的CD4靶向的颗粒确实特异性地激活并促进培养的原代CD4+细胞的存活，而基于NiV（尼帕病毒）糖蛋白的呈现IL-7的CD8靶向的颗粒选择性地激活并促进CD8+ T细胞的存活。此外，研究人员还发现，利用剂量依赖性方式，这些假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体能够有效地将GFP转基因递送至细胞混合物中的CD4+ T细胞中。与亲本CD4靶向的慢病毒载体（不共同呈现IL-7）相比，在将治疗性ErbB2CAR转基因选择性地递送到静息CD4+ T细胞方面，4H/IL7H-LV更有效。用共同呈现CD8/IL-7的NiV糖蛋白假型化慢病毒载体（8G/IL7G-LV）也观察到了类似的独特的基因转移和CD8+ T细胞的刺激。实际上，在选择性CD8+ T细胞活化和靶基因递送方面，8G/IL7G-LV比8G-LV更有效。这项研究为In vivo CAR-T疗法提供了一种新的、有效的策略，为未来的临床试验提供了重要的理论基础。

等待看下潜在买家是谁。CGT 高端治疗CTDMO业务（WuXi ATU）：受美国拟议法案影响，正在评估各种选项以保持业务的持续运营，避免对患者造成影响前三季度高端治疗CTDMO业务实现收入8.5亿元，经调整non-IFRS毛利率为(29.7)%。主要由于：1) 高毛利项目于2023年度完成；商业化项目仍处于放量早期阶段。 2) 部分项目延迟或因客户原因取消；以及受美国拟议法案影响，新签订单不足。公司持续加强CTDMO服务平台建设。截至2024年9月底，为总计59个项目提供工艺开发、检测与生产服务，包括2个商业化项目，4个临床III期项目（其中1个项目处于上市申请准备阶段），8个临床II期项目，以及45个临床前和临床I期项目。其中，新增世界首个创新肿瘤淋巴细胞疗法（TIL）商业化项目。公司正在为一项商业化CAR-T产品的慢病毒载体（LVV）生产做BLA申报准备，已完成工艺验证（PPQ），同时已开始PPQ后的生产，预计将在2024年第四季度申报FDA。另外，公司助力客户进行世界首例创新体内制造CAR-T疗法的临床试验，提供从质粒到病毒的工艺开发与GMP生产全流程服务。

基因调控全攻略𐟓š 在研究基因功能或验证药物靶点时，基因过表达、敲低和敲除是必不可少的步骤。很多科研人员可能对这些方法感到困惑，因此整理了一些体外细胞实验中常用的过表达、敲低和敲除方法，供大家参考。体内动物的基因编辑将在下一期讲解。基因过表达 𐟓ˆ 基因过表达是将目的基因的编码区序列（CDS）克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用载体骨架上的调控元件，使基因在人为控制下大量转录和翻译，从而实现目的基因的过表达。质粒：瞬时转染普通编码基因过表达 miRNA过表达 lncRNA过表达 circRNA过表达特点：过程简单：常规质粒载体通过常规转染即可将质粒转入细胞。载体容量大：有足够大的容量放置感兴趣的序列。表达水平高：表达水平较高。表达时间短：表达时间较短。慢病毒：稳定转染慢病毒重组载体构建完成后需要辅助质粒的参与才能包装形成病毒颗粒。通过对上清液中活体病毒的直接收集或进一步浓缩病毒后可用于转染靶细胞，释放到宿主细胞中的病毒RNA逆转录成双链DNA，进一步整合到宿主细胞的基因组中。感染谱广：感染范围广泛。稳定表达：通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上，可实现目的基因长期稳定表达。安全性高：安全性较高。包装容量有限：插入的外源基因需在4kb以下。包装滴度较低：包装滴度较低。基因敲低 𐟓‰ 基因敲低是利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。 siRNA：瞬时转染小干扰RNA（siRNA），是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。基因敲除 ✖️ 基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。 CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9技术是一种常用的基因编辑技术，通过在基因组中引入特定的DNA片段，实现基因的敲除。希望这些信息能帮助大家更好地理解和掌握基因过表达、敲低和敲除的方法，欢迎交流学习！

硫酸软骨素揭秘：椎间盘稳态 𐟔 通过基因敲除鼠和注射capsaicin构建去神经模型，发现硫酸软骨素合成减少，破坏了椎间盘的内环境稳态。 𐟓‰ 去神经导致退变程度加重，硫酸软骨素合成减少。注射capsaicin再次验证了这一现象。 𐟔젥œ襎𛧥ž经的小鼠模型中，硫酸软骨素合成的基因CHSY1、CHSY3和CHST3下调，其中CHSY1最为明显。 𐟔砦ž„建基因敲除鼠，发现CHSY1基因被成功敲除后，椎间盘细胞外基质代谢紊乱。 𐟓ˆ 野生型（未敲除CHSY1）去神经后，退变程度加重，硫酸软骨素减少。敲除CHSY1基因后，即使去神经也不会导致退变加重或硫酸软骨素减少。 𐟔젥œ觻†胞层面和免疫荧光验证中，CHSY1基因在感觉神经调控椎间盘细胞外基质稳态中的重要性得到证实。 𐟔젩€š过SDS-PAGE和GO富集分析，发现CGRP是主要的神经多肽，导致了CHSY1所致的硫酸软骨素合成减少。 𐟌𑠄RG（背根结神经元）分泌CGRP通过RAMP1/CREB通路促进髓核细胞CHSY1基因的表达。添加CGRP后，硫酸软骨素和CHSY1高表达。 𐟔젩듦 𘧻†胞和DRG共培养再次验证了CGRP的作用。NO-CGRP激活CREB磷酸化，阻断RAMP1后CGRP的上述作用减轻。 𐟐�€š过慢病毒载体注射消除DRG分泌CGRP，证实CGRP被消除。在野生型小鼠中消除DRG后，退变程度加重，硫酸软骨素合成减少；而在CHSY1敲除鼠中消除DRG不会影响退变和硫酸软骨素含量。 𐟓 以上研究证实了DRG分泌CGRP通过RAMP1/CREB通路作用于CHSY1基因调控CS（硫酸软骨素）合成，进而影响椎间盘的稳态。

一分钟搞懂基因过表达、敲低、敲除的区别嘿，大家好！今天咱们来聊聊基因操作里的三个常见术语：过表达、敲低和敲除。别担心，只需要一分钟，你就能搞懂它们的区别啦！基因过表达 𐟚€ 基因过表达，简单来说，就是把一个基因插到一个表达载体里，然后把这个载体转染到目标细胞里。这样一来，细胞就会大量表达这个基因和它编码的蛋白质。常见的载体有哺乳动物载体（用于人、小鼠等哺乳动物细胞）、原核载体（用于大肠杆菌等原核生物）和慢病毒载体（比如HIV、FIV、SIV、EIA）。构建这些载体的方法包括设计目的基因片段和载体、连接元件（用酶切或gateway连接），然后通过病毒载体、电穿孔或转染试剂导入目标细胞。基因敲低 𐟛‘ 基因敲低呢，主要是用抑制剂来抑制基因的表达。常见的方法有RNA干扰技术（RNAi）、CRISPR-Cas9技术和gene转染技术。比如，siRNA载体通过与目标mRNA互补结合序列，特异性地实现靶向mRNA降解。而CRISPR载体则包含CRISPR靶向序列和转录抑制子。构建这些载体的步骤包括设计干扰序列、合成和克隆、转化和筛选，最后通过病毒等途径导入目标细胞。基因敲除 ✂️ 基因敲除则是用含有已知序列的小DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合到受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。常见的载体有CRISPR/Cas9载体和TALENs载体。CRISPR/Cas9载体通过Cas9核酸酶和sgRNA靶向序列精确定位并靶向基因DNA序列，然后引入双链断裂点，完成基因敲除。而TALENs载体则包含特异性核酸酶和nuclease binding domain，通过切割靶向基因DNA序列，完成敲除和编辑。构建这些载体的方法包括设计和选择靶点、载体插入、转化和验证，最后通过病毒载体、电穿孔等方法导入目标细胞。总结 𐟓 总的来说，基因过表达、敲低和敲除这三种技术在生物学研究中有着广泛的应用。了解它们的原理和构建方法，可以帮助你更好地设计和执行实验。希望这篇文章能让你在短时间内对它们有个清晰的认识！如果你有任何问题或需要进一步的解释，欢迎在评论区留言哦！𐟘Š

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