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质粒小提试剂盒在线播放_全式金质粒小提试剂盒(2024年12月免费观看)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：导读更新日期：2024-11-29

质粒小提试剂盒

分子克隆实战指南：PCR篇 𐟔奈†子克隆的目的是构建目的基因重组体，并在细胞中验证其成功过表达。以下是主要流程： 1️⃣ PCR：获取目的基因TP53基因的CDS区（1182bp），通过PCR并经琼脂糖凝胶电泳验证条带，然后胶回收目的基因。 2️⃣ 酶切：将目的基因与载体用特定限制性核酸内切酶切割，暴露粘性末端，并分别胶回收这两部分。 3️⃣ 连接：用DNA连接酶连接暴露粘性末端的目的基因和载体。 4️⃣ 转化：将连接成功的环状产物转化到大肠杆菌感受态细胞。 5️⃣ 涂板：12-16小时后挑菌做菌落PCR验证。 6️⃣ 摇菌：直接摇菌中提（见之前菌落PCR笔记，可以省去小提步骤）。 7️⃣ 提取质粒并测序。 8️⃣ 转染：将质粒转染细胞24小时后（记得要有对照组，即只转染试剂组）。 9️⃣ 提取细胞总RNA。 𐟔Ÿ 逆转录成cDNA。 1️⃣1️⃣ 设计qPCR引物（Primer bank查询即可）。 1️⃣2️⃣ 实时荧光定量PCR检测目的基因TP53。 ⚠️注意事项： 1️⃣ PCR试剂盒选择：实验室之前使用Takara的Primer star高保真酶，后期发现很多国货非常好用，如ATG巨匠生物的ATG 2*Proofast Master Mix，PCR结果稳定，酶高保真且扩增效率高。 2️⃣ PCR程序设定的两个关键问题：退火温度：与引物性质有关，注意设计引物软件中的Tm值不应算上酶切位点和保护碱基，应只含互补配对部分，这时的退火温度才是准确的。理论上一定范围内，退火温度高时，特异性好。所以很多同学碰到有杂带的情况，可以适当提高退火温度；反之，如果条带不出，可以适当降低退火温度。延伸时间：延伸时间与片段长度有关，还与酶的延伸效率有关，可以参见DNA聚合酶的说明书。 3️⃣ 通过胶回收获得的产物是未暴露粘性末端的双链DNA，所以还需要后续的限制性核酸内切酶进行酶切，将载体和目的基因片段都暴露粘性末端，才能进一步连接。

分子克隆实验指南：从零开始到成功大家好！首先，非常感谢你们的关注和喜欢，真的很开心我的笔记能帮到大家。还记得最开始的那篇笔记，记录了我那次离谱的分子克隆实验，4个片段的同源重组竟然花了两个月！后来我慢慢发现，分子克隆其实非常微妙，有点像高中时的数学，学霸们轻而易举考100分，而我这种小学渣每次都在及格边缘反复横踩。所以，我想用这个账号记录我的科研日常，希望能和大家一起学习。之前的几篇笔记中，我分享过引物设计、载体酶切、同源重组等非常具体的实验方法。但最近我发现，很多粉丝朋友们刚开启自己的科研之旅，或者是偏向临床的科研大佬们，对分子克隆实验整体了解比较少。所以今天，我想跟大家分享一下质粒构建的大体流程。明确你的目标 𐟎斥…ˆ，在构建质粒之前，你需要有一个清晰的计划。明确你要使用哪种克隆方法，比如同源重组、TOPO克隆还是T4连接。TOPO/TA克隆不需要同源臂，而同源重组和T4连接是需要同源臂的。选择合适的载体 𐟚€ 根据你的实验目的，选择合适的表达载体。例如，常用的原核表达载体有pET28a，真核表达载体有pcDNA3.1，CRISPR/Cas9表达载体有Lenti-V2等等。载体可以通过酶切或者环形PCR后，跑胶回收所需的载体片段。设计引物并扩增片段 𐟔슦 𙦍€选的构建方法，设计并合成引物。PCR扩增需要插入的目的片段，PCR的产物也需要通过跑胶回收。连接与转化 𐟔„ 将载体和目的片段连接后，转入合适的感受态细胞内。例如，DH5˜“产生突变或者缺失，而Stable3相对更加稳定。但提质粒时需要使用试剂盒中的去蛋白液洗3遍，以充分去除核酸酶，减少后续对质粒酶切等实验的影响。通常连接产物的用量不超过总体积的1/20。然后在冰上静止20分钟，热激1分钟，再冰上静置3分钟，加入无抗的LB培养基，摇床摇40-60分钟，最后涂在合适抗性的LB平板上。培养与鉴定 𐟧ꊌB板子放在37度培养箱内过夜生长，第二天挑取单克隆细胞，置于合适抗性的LB培养基中摇菌，然后提质粒送测序公司测序。如果你想偷懒的话，也可以直接送菌液到公司哦，菌液和质粒的测序价格是一样的。今天就分享到这啦，希望这些内容对大家有用！如果有什么问题或者要补充的，欢迎评论或者私信哦！𐟘Š

分子生物学小技巧：质粒提取全解析 𐟧슨𔨧𒒦取是分子生物学实验中的基本操作，但你真的了解其中的原理吗？很多人只知道使用试剂盒中的P1、P2、P3溶液，却对具体成分和作用一知半解。今天，我们就来深入探讨质粒提取的背后原理，让你真正掌握这项技术！质粒提取的基本原理 𐟌 质粒是独立于染色体外能够自我复制的环状DNA分子。质粒提取采用的是强碱裂解法。基本原理是：细菌悬浮液暴露于高PH的强阴离子洗涤剂中，细胞壁被裂解，染色体DNA和蛋白质发生变性，相互缠绕形成大型复合物。然后被十二烷基硫酸盐包裹，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中沉淀下来，离心去除后，质粒DNA就存在于上清液中。由于DNA带负电，而质粒提取柱相当于一个阴离子柱，能够在高盐的条件下吸附DNA，然后通过去离子水洗脱，就得到纯化的质粒DNA了。 P1、P2、P3到底是什么？ 𐟧ꊐ1: 1M Tris-Hcl(PH8.0)25 mL + 0.5 MEDTA(PH8.0) 10mL 加超纯水定容至500mL，温热灭菌，常温保存。用时现加RNase。 P2: NaOH 4g + SDS 5g。加超纯水定容至500mL, 湿热灭菌, 常温保存。 P3: 乙酸钾147.21g + 冰醋酸57.5mL，加超纯水定容至500mL, 湿热灭菌, 常温保存。实验步骤详解 𐟏튥ꌥ‰试剂准备：从培养箱中取出前一天摇的菌液，从中取2mL离心，去上清，备用。P1在使用前加入RNA酶。菌体裂解：根据试剂说明，向含有菌体沉淀的EP管中加150 P1，震荡管底，使菌体全部溶解于溶液1中。然后加入150 P2，温和地上下翻转EP管8-10次。加入500 P3，立即剧烈翻转EP管8-10次，此时EP管中出现白色絮状沉淀。过柱纯化：将EP管12000转离心1分钟，用枪头小心地吸出上清液至收集柱中。12000转离心1分钟，弃去滤液，向收集管中加入500 PW漂洗液，12000转离心1分钟，弃去滤液，重复加入500 PW漂洗液，12000转离心1分钟，弃去滤液,12000转离心2分钟。把收集柱装入新的EP管中，室温晾干5分钟。在收集柱的膜中加入50提前预热的EB buffer或去离子水。室温静置1分钟。12000转离心2分钟。得到质粒DNA溶液。常见问题解答 𐟛 ️ 质粒提取的得率低或无质粒：可能是菌体老化或质粒拷贝数低。可以重新涂布筛选，挑选新的菌落进行液体培养。碱裂解不充分：收集的菌体含量较高时，可以酌情提高溶液P1、P2、P3的含量。乙醇残留：漂洗液没有去除干净。可以两遍醇洗以保证盐离子完全清除。洗脱处理不当：洗脱液加入较多或者洗脱时间过短。可以提前将洗脱液加热，从而加速DNA从柱体的脱离。质粒的纯化不足：可能混有RNA或基因组DNA。可以避免加入溶液P2、P3时剧烈震荡，减少菌体用量。总结 𐟓 看完这篇，你是不是对质粒提取的原理有了更深入的了解？下一期，我们将继续探讨大提质粒的技术。记得关注哦！

中量质粒提取，关键步骤！在分子克隆实验中，质粒的质量至关重要，它直接影响后续实验的效果。今天，我们来探讨如何使用EndoFree Plasmid Midi Kit进行中量提取/制备质粒，并分享一些关键步骤和注意事项。 𐟔 Part I: 准备工作确认P1溶液中已加入RNase，并记得及时放回4度保存。加入buffer P1后，用vortex充分混匀，确保菌块完全裂解。加入buffer P2后，温和混匀，避免打断基因组DNA。加入buffer E3后，立即混匀，防止局部沉淀。 𐟔 Part II: 激活与洗涤使用去内毒素的试剂盒，避免内毒素影响细胞实验。激活柱子，确保Buffer PW中已加入指定体积的100%乙醇。建议用Buffer PW再多洗涤一次，确保质粒纯净。 𐟔 Part III: 洗脱与预热将灭菌蒸馏水提前预热至60度，提高洗脱效率。去除吸附柱中残留的乙醇，以免影响后续酶促反应。建议分两次洗脱，以提高洗脱效率。 𐟑‰ 此外，建议在每一步的间隙为下一步做准备，比如捏管子做标记等，尤其是一天要提几百个质粒的情况。

质粒提取的四种方法及其适用范围质粒提取是一种常见的实验技术，用于从细菌或其他生物体中获取纯净的质粒DNA。质粒提取的目的是为了进行后续的分子生物学实验，如基因克隆、基因表达和转基因等。我们通常使用商业化试剂盒来进行质粒提取，这些试剂盒可以根据实验目的和样品来源进行分类。碱裂解法 𐟌꯸ 原理：碱裂解法利用碱性溶液破坏细菌细胞壁和细胞膜，从而使质粒DNA从细胞中释放出来。碱性条件会导致细胞膜和细胞壁的破裂，释放出质粒DNA。随后通过中和和沉淀步骤进行纯化，去除蛋白质和其他杂质。适用范围：碱裂解法适用于从大多数常见细菌中提取质粒DNA，特别适合小规模提取和常规实验。高盐法 𐟧‚ 原理：高盐法利用高盐浓度破坏细菌细胞膜和蛋白质，从而使质粒DNA从细胞中释放出来。高盐浓度会导致细胞膜的破裂和蛋白质沉淀，从而实现质粒DNA的纯化。适用范围：高盐法适用于从各种细菌中提取质粒DNA，包括一些难以处理的细菌株。这种方法对于大规模提取和高纯度要求的实验较为适用。硅胶柱层析法 𐟏튥ŽŸ理：硅胶柱层析法使用硅胶柱作为质粒DNA的吸附材料。样品中的质粒DNA在硅胶柱上结合，而杂质则被洗脱。然后通过洗涤和洗脱步骤，纯化质粒DNA。适用范围：硅胶柱层析法适用于从各种来源的细菌中提取质粒DNA，包括高GC含量的细菌。这种方法通常能提供较高的纯度和较好的质粒DNA回收率。磁珠法 𐟧ꊥŽŸ理：磁珠法利用磁性珠子表面的特定配体与质粒DNA结合，然后通过磁场将质粒DNA与磁珠分离。杂质则被去除，最后通过洗涤和洗脱步骤纯化质粒DNA。适用范围：磁珠法适用于从各种来源的细菌中提取质粒DNA。这种方法具有快速、高效、自动化的特点，适用于高通量实验和高纯度要求的实验。实验常见问题和措施 𐟚芦𑡦Ÿ“：在质粒提取过程中，可能会发生DNA污染，导致提取的质粒DNA样品的纯度下降。为了避免污染，需要注意使用无菌操作和洁净的实验环境。 DNA降解：DNA在提取过程中容易受到核酸酶的降解。为了保护DNA的完整性，可以在提取过程中添加核酸酶抑制剂，避免长时间曝光在室温下，以及避免多次冻融循环。低得率：有时候质粒提取的得率较低，可能由于菌落密度不足、提取方法不当等原因。为了提高得率，可以增加菌落培养的时间和密度，使用适当的提取方法，并根据实验需要优化提取步骤。在进行质粒提取实验时，需要注意操作规范和控制实验条件，以确保提取的质粒DNA质量和纯度的准确性和可靠性。

𐟧쨴觲’转化操作全攻略𐟒‰ 𐟔쥮ž验步骤大揭秘： 1️⃣ 将感受态细胞放置在冰盒上解冻，同时准备好质粒和EP管。 2️⃣ 解冻后，取50感受态细胞加入EP管，再加入0.5-1质粒，冰浴30分钟。 3️⃣ 水浴锅42℃热激60秒，继续冰浴5分钟。 4️⃣ 在超净台内加入500无抗性LB液体培养基，摇床37℃、180rpm孵育15-30分钟。 5️⃣ 离心后去上清，剩余部分轻轻混匀。 6️⃣ 涂板，标记好平板后，取10-20液体涂板，倒置37℃培养过夜。 7️⃣ 第二天观察菌落，合格后封存于4℃。 8️⃣ 挑取单克隆菌落，放入氨苄抗性LB液体培养基中，摇床培养过夜。 9️⃣ 使用试剂盒抽质粒，根据说明书操作。 𐟌Ÿ经验分享时刻： - 感受态细胞-80℃保存，转化前冰上融化。 - 摇床孵育时间根据质粒情况调整。 - 培养基抗生素选择需仔细阅读说明书。 - 涂板量可自行调整，普通质粒可取30涂6cm平板。 - 培养时间一般过夜即可，菌落大小适中时挑菌。 - 提质粒前测OD600值估算细菌浓度。 - 转化前务必阅读质粒说明书，选择合适感受态细胞。 𐟒ᥰ贴士：实验过程中注意无菌操作，确保实验结果准确可靠哦！

酵母菌落鉴定：两种方法优缺点大比拼在进行酵母菌落鉴定时，我们通常会选择两种方法：酵母质粒提取后鉴定和反复冻融法。以下是这两种方法的详细介绍及其优缺点比较：酵母质粒提取后鉴定 𐟧슦Œ‰照酵母质粒提取试剂盒的说明书进行操作，主要使用裂解液和破壁酶来破壁酵母细胞，然后通过提取到的质粒作为模板进行PCR。优点：鉴定效果显著，能够有效进行阳性鉴定。缺点：耗时较长，操作复杂。反复冻融法 ❄️ 将收集的菌落加100ul水重悬后，在98℃和液氮之间往返3次，每次在98℃和液氮中分别进行5min。优点：省时省力省钱，操作简便。缺点：如果破壁不完全，可能会错失阳性菌，如图中的基因4和基因5。大家可以根据实际情况选择合适的方法，祝实验顺利！

质粒转化实验全攻略：从准备到提取质粒的转化实验主要包括三个部分：感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和质粒DNA的提取。以下是详细的步骤：（Ⅰ）感受态细胞的制备从活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。将菌悬液按照1:100的比例转接到100ml液体培养基中，37℃振荡扩大培养，2~3小时。当培养液开始浑浊时，间断性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。将培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20分钟，0℃-4℃离心10分钟（4000r/min）。弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30分钟。（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率） 4℃离心10分钟（4000r/min）。弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。可直接用于实验，4℃保存。也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。（Ⅱ）质粒DNA的转化取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入1ul质粒DNA混匀，同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最后一点冰融化后，迅即加入DNA。若解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。冰浴30分钟，离心管放到42℃保温90秒（不要摇动离心管）。冰浴时间短于30分钟，可能影响转化率。然后迅速冰浴2分钟。向离心管加800ul LB液体培养基，37℃振荡培养1小时（150r/min）。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最佳效果。取适当（50ul）的复苏细胞培养液，涂布在含抗性的选择性培养基上，将培养皿放置在37℃恒温培养箱中，正置30分钟。等菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中，培养12~16小时，出现菌落。菌落结果：无菌落：失败或者培养条件不充分。布满菌落：呈苔样，失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致。布满菌落：浓度太高，失败。出现菌落：符合要求。（Ⅲ）质粒DNA的提取质粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒，实验操作简单，只需按照产品操作说明操作即可。

定点突变：科研中的小技巧与心得 𐟔在科研中，探究蛋白质功能的一个关键方法是定点突变。通过改变蛋白质中的一两个氨基酸残基，可以研究这种变化对蛋白质结构和功能的影响。 𐟔基因定点突变（site-directed mutagenesis）是一种定向改变蛋白质序列的方法。首先确定要改变的氨基酸残基位置，然后通过PCR技术定向修改基因序列，从而探讨蛋白质功能的变化。 ✍️以下是一些在进行定点突变时发现的问题和心得体会： 1️⃣ 试剂选择：很多研究者为了方便直接购买昂贵的试剂盒，其实可以选择同一品牌的散装试剂，如高保DNA聚合酶和游离碱基等。参考试剂盒的说明书，可以自行配制类似效果的体系。 2️⃣ 引物设计：设计引物时，尽量保持GC含量较低，但退火温度要适当高一些，建议在65℃左右。如果突变位点附近GC含量高，可以考虑使用GC rich buffer，可以有效提高突变成功率。 3️⃣ PCR体系优化：定点突变的关键在于引物设计和PCR体系的设置。延伸和后延伸的温度和时间非常重要。延伸时间根据使用的聚合酶质量来定，后延伸一般设置为10-15分钟。延伸温度选择68℃或72℃，退火温度尽量低于延伸温度1-2℃。 4️⃣ 琼脂糖电泳回收：是否需要将突变质粒进行琼脂糖电泳回收去杂，这并不是必要的步骤。残留的聚合酶和游离碱基等对转化BL21受体菌的影响不大，反而可能降低转化率。 5️⃣ DpnI酶消化：如果条件允许，可以使用DpnI酶消化模板质粒。经过多轮PCR反应后，模板质粒已经很少了，因此带来的假阳性可以忽略不计。后续可以通过双酶切和测序验证是否为阳性突变子。通过这些小技巧和心得体会，可以有效提高定点突变的成功率，为科研工作提供有力支持。

𐟌Ÿ双荧光素酶报告系统必备资源库𐟌Ÿ 在双荧光素酶报告系统的研究中，以下四个资源库网站是科研人员的好帮手，赶紧收藏吧！ Promega 𐟏𗯸：这家公司提供多种荧光素酶底物和试剂盒，满足双荧光素酶报告实验的各种需求。 Addgene 𐟏𗯸：这是一个非营利性的生物资源库，提供质粒和表达载体，包括荧光素酶相关的质粒，方便研究人员进行基因转染和表达。 NCBI 𐟏𗯸：美国国家生物技术信息中心提供了多个数据库，如PubMed、GenBank、Gene等，可以搜索和获取与双荧光素酶报告系统相关的文献、基因序列和蛋白质信息。 PubChem 𐟏𗯸：这是NCBI的化学物质数据库，提供大量的化合物信息和生物活性数据，有助于荧光素酶底物的筛选和选择。这些资源库网站在双荧光素酶报告实验中发挥着重要作用，大家在平时的实验中是否都使用过呢？如果需要更多帮助，可以考虑使用这些资源库网站哦！

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