当前位置：网站首页 » 教程 » 内容详情

gapdh前沿信息_gapdh分子量(2024年11月实时热点)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：教程更新日期：2024-11-28

gapdh

科研日记：小鼠皮肤蛋白提取失败原因大揭秘快三个月没跑WB了，结果一出来就给我这么大的“惊喜”，各种问题层出不穷，真是笑死我了𐟘‚。样本来源：C57小鼠皮肤（1%SDS裂解，默克蛋白酶抑制剂，磷酸化酶抑制剂）电泳参数：金斯瑞的预制胶，电泳80v 10min，120v 60min，转膜湿转250mA 60min 抗体比例：5%BSA封闭2小时，一抗GAPDH过夜（abcam 1:10000），二抗羊抗兔1小时（三鹰 1:10000），洗膜10分钟X3 样本是昨天提取的，除了转膜液，其他都是新配的。所有问题都集中在一张膜上，真是“教科书”级别的失败案例啊𐟙‹。朋友们，快来讨论下可能的原因吧！

内参是什么意思在Western Blot实验中，内参可是个关键角色，它就像是个“参照物”，用来标准化蛋白质表达水平。内参蛋白通常是在细胞中普遍表达且表达水平相对稳定的蛋白质，这样它的表达就不会被实验条件或者处理影响。我们做Western Blot，除了想知道目的蛋白在细胞或组织中是否表达，更关键的是要知道它表达量的高低。而内参就是来帮我们调整上样量的，让目标蛋白的信号有个参照。内参蛋白的选择：关键因素表达水平 𐟓Š 内参蛋白在实验样本中应该普遍表达，且表达水平要稳定。通常我们会选择表达量较高的内参蛋白，这样在Western Blot中才能检测到明显的条带。比如，GAPDH是个不错的选择，因为它是个代谢类蛋白，在活组织中的表达比较恒定。而Actin和Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异，所以选择时要慎重。分子量 𐟓 内参蛋白的分子量要和目的蛋白有明显差异，这样才能在Western Blot中区分开。通常我们会选择分子量较大或较小的内参蛋白，以避免与目的蛋白的分子量重叠。一般建议内参与要检测的蛋白分子量最好相差5kDa以上。物种来源 𐟌 内参蛋白的物种来源要和实验样本一致，以避免种属间的差异。如果实验样本来自不同的物种，可以选择在多个物种中表达相对稳定的内参蛋白。细胞类型和组织类型 𐟏劥†…参蛋白的表达水平可能因细胞类型和组织类型而异。因此，在选择内参蛋白时，要考虑实验样本的细胞类型和组织类型，选择在相应细胞类型和组织类型中表达相对稳定的内参蛋白。实验条件 𐟌᯸ 某些实验条件可能会影响内参蛋白的表达水平。例如，缺氧或者诱导糖尿病等处理时，GAPDH的表达会增高，所以不能用来做内参。因此，在选择内参蛋白时，要考虑实验条件对其表达水平的影响。小结选择合适的内参蛋白可是Western Blot实验的关键一步，选对了才能让你的数据更准确、更可靠。希望这些小贴士能帮到你，让你的实验更加顺利！𐟒ꀀ

内参选择在进行Western blot实验时，选择合适的内参至关重要。以下是选择内参时需要考虑的几个关键因素：蛋白表达丰度：内参应在样本中稳定表达，且表达量相对较高，以确保能够有效地检测到内参信号。分子量：内参的分子量应与目标蛋白的分子量有明显差异，以便在电泳分离时能够分开。细胞类型和组织特异性：根据实验样本类型，选择适合的内参。例如，actin常用于哺乳动物细胞，而Tubulin则更适合检测细胞骨架蛋白。推荐使用一些常见的内参，如actin、GAPDH和HSP90。这些内参在大多数细胞类型中都有稳定表达，且分子量适中，容易检测。在选择内参时，还需要注意一些实验细节。比如，确保内参和目标蛋白的抗体不相互干扰，并且在实验中正确地设置对照组，以验证内参的表达是否稳定。

雅酶胶过期，WB实验告急！ 𐟘𑤻Š天才发现，我的雅酶10%胶竟然过期两年了！𐟤梀♀️ 𐟔젨🛨ጤ𚆗B实验，电泳条件是80v30min和120v55min，转膜时用了12v40min，结果发现条带都跑到棉片的背面了，看来转膜时间太长了。𐟘“ 𐟥𒠧”𑤺Ž担心再次剪坏条带，我决定尝试同时敷一抗和内参。 𐟧ꠤ𝿧”褺†ERK1/2和GAPDH抗体，幸运的是没有出现双条带，但条带的量并不多。 𐟒‰ 骨组织裂解液使用了60mg+200ul，其中加入了磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。 𐟤” 有没有小伙伴能给我一些指导呢？我的实验好像出了点问题。𐟘

内参不齐 Western Blot实验中，调整内参是关键的一步。以下是一些实用的技巧，帮助你快速且稳定地调整内参：选择合适的内参：可以查阅文献、遵循师门传统或通过通跑测试来选择合适的内参，例如GAPDH、Tublin或beta-actin等。 BCA法测定组织蛋白浓度：虽然有时候测完也不齐，但在测完的基础上调整更为方便。细胞铺板均匀：细胞不需要测BCA，但需要保证铺的板细胞均匀，这样上样量才能更准确。统一浓度上样：先统一浓度上样，再根据发光结果进行相应调整。浓的少加，淡的多加，这主要靠经验。确保电泳、转膜、封闭无误：在调整上样量之前，必须保证电泳、转膜和封闭没有问题，这样调整才能更准确。通过这些步骤，你可以更有效地调整内参，使Western Blot实验更加准确和可靠。

𐟌𑠥𜕧‰騮𞨮᥅覔𛧕导š从理论到实践！引物设计的基本原则 𐟓œ 选择目的基因的共有外显子区域进行设计。引物长度建议在20到25bp之间，GC含量保持在40%到60%，Tm值最好在60℃左右。设计引物时，尽量跨越外显子，上下游引物可以位于不同的外显子上。引物的self complementarity和self 3' complementarity相加值应不超过8，单个值不超过5。扩增产物长度建议在80到300bp之间，最佳为80到150bp。避免设计含有4个或以上相同碱基（如AAAA、TTTT、GGGG、CCCC）的引物，以及避免明显的二级结构。设计流程 𐟖寸使用NCBI在线设计工具：进入NCBI网站，搜索目的基因（如GAPDH）。查看详细信息，找到共有外显子区域。选择转录本信息，查看外显子位置。进入引物设计页面，填写相关信息。设置引物参数，如PCR产物大小、跨越外显子等。点击“Get Primers”获取引物序列。结果解读 𐟓Š 在Graphical view of primer pairs部分查看每对引物跨越外显子的情况。在Detailed primer reports部分查看引物质量和匹配情况。通过以上步骤，你就可以轻松完成引物设计啦！𐟎‰

ABmart抗体：科研实验的得力助手𐟑 ABmart的抗体真的是国货中的佼佼者，用过一次你就会爱上它。它的条带特别清晰，曝光效果极佳。我使用的是ABmart提供的抗体试用装，几乎所有的WB实验都用的是ABmart的抗体。以下是我跑WB实验的结果，LC3和内参GAPDH的条带都非常清晰。 LC3抗体货号T55992，GAPDH抗体货号M20006。跑LC3蛋白的实验条件是：12%的胶，先60V跑30分钟，然后120V跑80分钟。转膜使用的是伯乐半干转，15分钟。封闭用的是5%脱脂牛奶，封闭时间为1小时。一抗在4度下孵育过夜，二抗用1:10000的比例，室温孵育1小时。 ABmart的抗体真的是科研实验的好帮手，强烈推荐给大家！

𐟤”跑内参全双条带解析𐟧 𐟧꥜襮ž验中，你是否遇到过跑内参全双条带的情况？这确实让人头疼。𐟘㠊 𐟔首先，让我们回顾一下实验步骤。在孵育gapdh时，原本分子量应是36kb，却在15kb处显影。𐟤𗢀♂️ 裁掉15kb以下后重新显影，能看到36kb的条带，但问题依旧存在。 𐟒ᦍ⤺†一抗、封闭液和二抗后，结果仍然一样。而且，不管是gapdh还是b-actin，杂带都相当多，整张膜上显示出两个较黑的条带，距离也不远。𐟘“ 𐟤”这究竟是不是样本的问题呢？其实，提完蛋白后不到一个礼拜，煮蛋白变性后放置在-20℃，这是常规操作。而且，用同一批样本也曾做出过整齐的内参。𐟤𗢀♀️ 𐟒ᩂ㤹ˆ，究竟是什么原因导致了全双条带的现象呢？这可能需要我们从实验的各个环节去仔细排查，包括实验设计、操作步骤、试剂质量等。𐟔 𐟒ꥸŒ望这些信息能对你有所帮助！如果你有任何疑问或需要进一步的建议，随时告诉我哦！𐟘Š

WB内参选择指南：灵活运用，事半功倍 𐟚€ 在进行蛋白质印迹（Western Blot）实验时，选择合适的内参至关重要。内参是实验中的“稳定分子”，用于标准化目标蛋白的相对表达量。以下是不同实验条件下内参选择的建议：细胞骨架相关蛋白：如果研究的是与细胞骨架相关的蛋白，如肌动蛋白（Actin），那么肌动蛋白（actin）可能不是最佳选择，因为它在细胞骨架重组时可能会受到影响。可以考虑使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）或线粒体蛋白作为内参。细胞分裂与凋亡相关蛋白：对于研究细胞分裂或凋亡相关蛋白的实验，选择与细胞周期相关的内参，如cyclin B或Mcl-1，可能更为合适。诱导后或修饰型蛋白：在进行诱导处理或检测磷酸化、乙酰化等修饰型蛋白时，建议选择结构蛋白如肌动蛋白（actin）和微管蛋白（tubulin）作为内参。因为GAPDH是代谢类蛋白，其表达量可能会受到诱导处理的影响。分泌型样本：在检测血浆、乳汁、组织液等分泌样本时，由于这些样本没有完整的细胞结构，可以选择分泌型蛋白如转铁蛋白（Transferrin）作为内参。抗癌与真菌药物：在使用抗癌和真菌药物时，由于tubulin的表达可能会受到影响，因此不适合作为内参。多组织多细胞样本：在进行多组织多细胞样本对比时，建议选择GAPDH作为内参。因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中的表达较为恒定，而肌动蛋白（actin）和微管蛋白（tubulin）等结构蛋白在不同组织的表达可能会有差异。细胞核内参：PCNA是细胞核的内参蛋白，在DNA S期表达，因此对于非增殖细胞不推荐使用。通过灵活运用这些内参选择建议，可以提高实验的准确性和可靠性，让你的研究更加深入和全面。

HIF指标搞定！abmart助力折腾了好久，终于把缺氧指标之一的HIF1ž定了，真是感谢abmart的救命之恩！𐟙 首先，我查了一下资料，发现缺氧指标在常氧下几分钟就降解了，所以我在乏氧箱里提蛋白。因为乏氧箱不太好操作，我就用预冷的PBS洗了一遍，然后加入含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，刮到EP管里，接下来就是正常的提蛋白步骤了。缺氧的情况下，好像不能用GAPDH做内参，所以我用了ACTIN内参，之前也试过TUBULIN内参，效果也不错。 HIF指标是用7.5%的胶跑的，电泳150V 60分钟，转膜是免冰浴400mA 45分钟，用的是成品无蛋白封闭液，封闭半小时，一抗4℃过夜，二抗室温1小时。还是挺顺利的，跑了两次就搞定了。感觉提蛋白这一步很重要，避免降解，抗体也很关键，有些抗体杂带太多，真是让人头疼。 Bcl-2我用的是12%的胶，电泳和转膜参数同上。一开始用0.2的膜，后来发现0.45的也很OK。有时候WB真是个玄学[捂脸R]。样品跑了两次后，感觉还是需要涡旋一下再离心，取上清来做WB比较好。中间有几次突然内参就不齐了，真是当头一棒[失望R]。我要跑的指标比较多（abmart的试用装真是救大命了[赞R]），有些蛋白分子量太接近，整膜要跑两张。为了避免混乱，我用蓝色圆珠笔在左上角写编号，还可以区分正反面。经过马克笔、铅笔、圆珠笔的实验，我发现圆珠笔最好用，强推！预祝各位道友SCI顺利accept！！[得意R][得意R][得意R]

专栏内容推荐

1969 x 1425 · jpeg
Frontiers | GAPDH in neuroblastoma: Functions in metabolism and survival
素材来自:frontiersin.org
1516 x 1496 · jpeg
GAPDH Protein Overview | Sino Biological
素材来自:sinobiological.com

2080 x 1400 · png
GAPDH Antibody (D16H11) XP® Rabbit mAb | Cell Signaling Technology
素材来自:cellsignal.cn
素材来自:thermofisher.com

600 x 376 · jpeg
Protein species (GAPDH P04406) derived from the GAPDH gene. Siah1 ...
素材来自:researchgate.net
1865 x 1200 · png
Anti-GAPDH antibody ValidAb™ | GAPDH Loading control | Hello Bio
素材来自:hellobio.com

550 x 395 · jpeg
GAPDH-Mediated Autophagy | Encyclopedia MDPI
素材来自:encyclopedia.pub
697 x 800 · jpeg
GAPDH Antibody - Purified Mouse Monoclonal Antibody (Mab) WB, IHC-P, IF ...
素材来自:abcepta.com.cn

2099 x 833 · jpeg
Filling a GAP(DH) in Caspase-Independent Cell Death: Cell
素材来自:cell.com

671 x 503 · jpeg
GAPDH Antibody HRP-60004 | Proteintech
素材来自:ptgcn.com
596 x 594 · jpeg
GAPDH Mouse Monoclonal Antibody | ABP Biosciences
素材来自:abpbio.com.cn

850 x 726 · png
Kinetics and coenzyme binding of GAPDH complexes. (A) View of GAPDH ...
素材来自:researchgate.net
1350 x 920 · jpeg
GAPDH antibody (60004-1-Ig) | Proteintech
素材来自:ptglab.com

1024 x 768 · jpeg
GAPDH Antibody 60004-1-Ig | Proteintech
素材来自:ptglab.co.jp
520 x 350 · jpeg
GAPDH Antibody (14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology
素材来自:cellsignal.com

640 x 640 · jpeg
GAPDH protein: protein interactions: dynamics of subcellular ...
素材来自:researchgate.net
853 x 939 · jpeg
GAPDH antibody (60004-1-Ig) | Proteintech
素材来自:ptglab.co.jp

640 x 640 · jpeg
SNO-GAPDH regulation of heme biosynthesis and iNOS activity | Download ...
素材来自:researchgate.net
850 x 1289 · png
GAPDH on surface of cells interacts with Plg. A) Expression of GAPDH on ...
素材来自:researchgate.net

850 x 1096 · jpeg
Cryo-EM structure of human GAPDH. (A) Cryo-EM maps of human GAPDH. The ...
素材来自:researchgate.net
1024 x 768 · jpeg
GAPDH Antibody 10494-1-AP | Proteintech
素材来自:ptgcn.com

410 x 419 · png
GAPDH Protein Overview | Sino Biological
素材来自:sinobiological.com
650 x 534 · jpeg
GAPDH Antibody, HRP (PA1-987-HRP)
素材来自:thermofisher.cn

850 x 961 · png
Native and mutant model of GAPDH. (A) Native GAPDH protein model built ...
素材来自:researchgate.net
1024 x 768 · jpeg
GAPDH Fusion Protein Ag0766 | Proteintech
素材来自:ptgcn.com

素材来自:thermofisher.com

1159 x 1024 · png

GAPDH antibody (60004-1-Ig) | Proteintech

素材来自:ptglab.com

850 x 563 · jpeg
GAPDH protein levels, a well-known CMA substrate, increase in POMC-like ...
素材来自:researchgate.net
1160 x 637 · jpeg
GAPDH antibody (IR3-8) | iReal Biotechnology, Inc.
素材来自:irealbio.com

655 x 565 · png
GAPDH is an Hsp70-binding protein. (A) Co-localization of GAPDH and ...
素材来自:researchgate.net
850 x 397 · jpeg
GAPDH protein: protein interactions: dynamics of subcellular ...
素材来自:researchgate.net

1920 x 831 · png
Anti-GAPDH antibody ValidAb™ | GAPDH Loading control | Hello Bio
素材来自:hellobio.com

700 x 657 · jpeg
GAPDH Antibody (Monoclonal, 6C5)
素材来自:thermofisher.com
800 x 600 · jpeg
GAPDH antibody (60004-1-Ig) | Proteintech
素材来自:ptglab.co.jp

1360 x 1024 · jpeg
GAPDH Antibody 60004-1-Ig | Proteintech
素材来自:ptgcn.com

素材来自:查看更多內容

当前用户设备UA：Mozilla/5.0 AppleWebKit/537.36 (KHTML, like Gecko; compatible; ClaudeBot/1.0; +claudebot@anthropic.com)