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封闭液最新娱乐体验_封闭液配方(2024年12月深度解析)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：话题更新日期：2024-11-29

封闭液

Western Blot测p38秘籍最近做了一次Western Blot，检测到了p38，分享一下经验供大家参考。 𐟌🠦Š—体选择：使用的是Abcam的抗体，具体货号在图3和图4中。 𐟌🠧𛆨ƒž蛋白提取：用RIPA裂解液（200ul/孔，6孔板）提取细胞蛋白。 𐟌🠧”𕦳𓦝᤻𖯼š转膜前，加入预染蛋白煮15分钟。上样量40ug，使用雅酶预制胶10%（PAGE）进行电泳，先以80V跑30分钟，再以100V跑40分钟。Marker使用的是雅酶的。 𐟌🠨𝬨†œ操作：在冰浴中，以230mA电流转膜90分钟，确保电压保持在130V以下。 𐟌🠥𐁩—�‡程：使用碧云天QuickBlock™ Western封闭液（货号P0252），封闭30分钟。 𐟌🠤𘀦Š—孵育：一抗pp38和p38均按1:1000的比例用雅酶的一抗稀释液稀释，放在4度冰箱摇床上过夜。蛋白显影在41kDa左右。希望这些信息对大家有所帮助！

原位杂交实验全攻略：从准备到显色 𐟧ꠥꌥ‰准备在进行原位杂交实验之前，你需要准备一系列试剂和耗材。试剂包括2㗣€0.5㗣€0.2㗧š„SSC缓冲液、DAB试剂盒和原位杂交试剂盒（包含蛋白酶K、预杂交液、杂交液、封闭液、兔抗地高辛抗体、HRP-山羊抗兔IgG）。仪器和耗材则有赛默飞F1单道移液器、QSP盒装吸头、湿盒、切片缸、温箱、硅化盖玻片等。 𐟔젦 𗥓玻片制备首先，你需要制备细胞涂片。将2-3滴PBS重悬的细胞液滴在涂有多聚赖氨酸的载玻片上，然后在培养箱中干燥5分钟。 𐟌🠦‚交前处理接下来，进行杂交前处理。滴加1/mL的蛋白酶K稀释液，37Ⰳ下细胞通透30分钟，然后用0.1mol/L的甘氨酸溶液终止消化。 𐟌€ 预杂交用吸水纸轻轻吸去多余的液体，滴加20的预杂交液，盖上硅化盖玻片，37Ⰳ湿盒孵育30分钟。然后用0.2㗓SC缓冲液室温洗3次，每次洗涤5分钟。 𐟌᯸ 杂交擦去周围多余的液体，滴加20的杂交液，盖上硅化盖玻片，将切片置于90Ⰳ环境下孵育10分钟。接着将切片置于盛有2㗓SC缓冲液的湿盒中，37Ⰳ孵育过夜。 𐟌Š 杂交后处理轻轻揭去盖玻片，42Ⰳ预热的2㗓SC缓冲液洗2次，每次5分钟；37Ⰳ预热的0.5㗓SC缓冲液洗1次，每次15分钟；0.2㗓SC缓冲液洗1次，每次15分钟。然后滴加封闭液37Ⰳ孵育30分钟，去除多余的液体。接着滴加兔抗地高辛IgG，湿盒37Ⰳ孵育30分钟。轻轻去除多余的液体，浸泡在PBS中5分钟。最后滴加HRP-山羊抗兔IgG，将切片放入湿盒中37Ⰳ孵育30分钟。 𐟎蠦˜𞨉𒊥Ž𛩙䥤š余的液体，滴加新鲜的DAB工作液显色20分钟，用蒸馏水终止显色。最后在显微镜下观察结果。 𐟓Š 结果分析经过DAB染色后，实验组阳性信号呈棕黄色，位于胞浆中。

细胞培养与免疫荧光染色全攻略一、细胞接种 𐟧슥œ覗菌条件下，打开Slide I biTreat的包装，并将其放在Slide滑架上。使用移液枪向通道中加入100  3㗱0^5 cells/mL Rat1细胞悬液。用提供的盖子轻轻盖住储液池，但不要完全密闭。将滑架放入培养箱中培养（37℃；5% CO2）60分钟，使细胞贴壁。然后向两个储液池中每池加入0.5 mL的无细胞培养基。孵育过夜。二、细胞固定 𐟔犤𝿧”觧𛦶𒦞ꥐ𘥎𛥂覶𒦱 中的全部培养基。用1 mL杜氏磷酸盐缓冲液缓慢加入一个空储液池中，并从另一个储液池中吸出，不要一次性吸去整个通道中的液体。用同样的方法加入约200 的3.7%多聚甲醛（用磷酸盐缓冲液配制）以固定细胞。从通道的另一侧吸去储液池中的内容物，等待10分钟。三、破膜与封闭 𐟛᯸ 按照步骤5所述，用1 mL磷酸盐缓冲液再次洗涤细胞。用约200  0.1% Triton X-100破膜液（用磷酸盐缓冲液配制）处理细胞3-5分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞。用约200  1% BSA封闭液（用磷酸盐缓冲液配制）处理细胞20分钟。用适量磷酸盐缓冲液洗涤细胞。四、染色与封片 𐟎芥𘥎𛩀š道中的所有液体，不要使通道干燥。使用100  Alexa Fluor 488鬼笔环肽（1 U鬼笔环肽+ 500 磷酸盐缓冲液+1% BSA封闭液，购自Invitrogen公司）并在室温下培养20分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞并清空通道。使用100  DAPI（0.1 /mL，购自Sigma-Aldrich公司）染色3-5分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，并去除所有液体。使用滴管瓶在储液池中注入100  ibidi封片剂。用随附的盖子密闭储液池。在荧光显微镜下用适当的滤光片组观察细胞。

WB实验常见问题及原因总结 𐟔 转膜不充分膜未完全湿透：使用100%甲醇浸透膜。靶蛋白分子量小：选择小孔径膜，缩短转移时间。靶蛋白等电点接近缓冲液pH：尝试使用CAPS缓冲液（pH 10.5）或低pH缓冲液如乙酸缓冲液。甲醇浓度过高：降低甲醇浓度，或使用乙醇或异丙醇代替。转移时间不足：对于厚胶和高分子量蛋白，延长转移时间。 𐟌ˆ 背景高膜未完全湿透：使用100%甲醇浸透膜。洗膜不充分：增加洗液体积和洗涤次数。阻断不充分：增加封闭液孵育时间，提高温度，选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉、BSA、酪蛋白等）。二抗浓度过高：降低二抗浓度。膜干燥：保证充分的反应液，避免干膜现象。曝光过度：缩短曝光时间。抗体与阻断蛋白交叉反应：检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应。 𐟚렦𒡦œ‰阳性条带抗体染色不充分：增加抗体浓度，延长孵育时间。酶失活：直接将酶和底物混合，如果不显色则说明酶失活。选择在有效期内、有活性的酶联物。标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低：设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有，则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量。试剂不匹配：一抗与组织种属、一抗与二抗或底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照验证二级检测系统的有效性。一抗失效：选择在有效期内抗体；现配现用工作液。 HRP抑制剂：所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

WB实验全攻略：从电泳到曝光 𐟓– SDS-PAGE 电泳上样：首先，用斜插板固定玻璃板，确保底部对齐，避免漏胶。将分离胶灌到适当的高度，可以用梳子测试一下，梳子齿距离分离胶上液面大约7mm为宜。然后用异丙醇或蒸馏水封胶，静置30分钟。接着，将浓缩胶缓慢均匀地加入到分离胶上层，直至加满，加上梳子，20分钟后待分离胶凝固。向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部，玻璃板内侧液面高于外侧。然后开始上样，每孔总上样量在20 以内，上样时间要短，避免样品扩散。 𐟔„ 转膜转膜的摆放顺序为：阴极碳板+海绵+三层滤纸+胶+膜+三层滤纸+海绵+阳极碳板。将电泳完毕的凝胶放入转膜缓冲液中，采用“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的转膜液浸透过的海绵垫，再各放一块滤纸，凝胶平稳地放在阴极滤纸上。然后将已经用甲醇激活过的PVDF膜放在凝胶的上方，去除气泡，夹好夹子，将转印夹放入转印槽中。 𐟧ꠥ𐁩—�Ž抗体孵育将转印完的膜放入装有 PBST 的孵育槽中，快速漂洗一次，然后加上脱脂牛奶，放置脱色摇床上，室温下封闭 60 分钟。按照抗体说明书，进行一抗稀释，配置好后，倒掉孵育槽中的封闭液，加入配置好的一抗，4℃孵育摇床过夜（摇床慢摇）。回收一抗，用 PBST 快速洗膜三次，然后加入 PBST，放置脱色摇床上快速洗脱，每次 10 分钟，洗三次。将二抗用 PBST 按照 1:5000 的比例进行稀释，然后加入孵育槽中，放置摇床上慢摇，室温下孵育60分钟。PBST 快速洗膜三次，然后再加入 PBST，放置脱色摇床上快速洗脱，每次 10 分钟，洗三次。 𐟓𘠦›光根据条带深浅调整曝光时间。 𐟓‹ 实验参数制胶体系：分离胶A液2.5 mL+分离胶B液2.5 mL；浓缩胶A液1 mL+浓缩胶B液1 mL；50  AP 电泳配方：SDS 1g+Glycine 18.77g+Tris 3.03g+纯水1000 mL 转膜配方：Glycine 14.42g+Tris 3.03g+甲醇 150mL+纯水 850mL 电泳条件：上层胶（浓缩胶）30分钟，下层胶（分离胶）1小时转膜条件：30分钟（快速转膜液）封闭时间：1小时封闭后洗膜时间：10分钟㗳一抗浓度：说明书一抗后洗膜时间：10分钟㗳二抗浓度：说明书二抗后洗膜时间：10分钟㗳

WB实验迷茫？看这篇就够！ 1⃣️ 如何避免胶跑得不漂亮？配胶：清洗玻璃板并检查是否漏气，避免胶凝固不均匀。倒胶时要充分混合并去除气泡。双蒸水或乙醇隔离时，缓慢加入，避免稀释分离胶。平衡：将配置好的胶放入点泳池，室温放置10分钟，待胶与电泳液温度一致再进行电泳。上样：拔出上样梳时要保持水平，避免上样孔倾斜。在样品两侧增加等体积的空白1x loading buffer孔，避免两侧样品条带扩宽。电泳：小电压能使胶的分子筛效应更好。电压越小，条带越漂亮。浓缩胶55V，分离胶75V电泳效果最佳，但时间长。 2⃣️ 电泳中常见现象： “︶” 条带呈笑脸状 “︵” 条带呈皱眉状条带拖尾纹理（纵向条纹）条带偏斜条带两边扩散 3⃣️ 如何降低WB背景？膜封闭不够：建议延长封闭时间，选择合适的封闭液。一抗稀释度不适宜：太高时选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育温度偏高：建议4℃过夜孵育。膜选择不当：NC膜的背景通常比PVDF膜低，但吸附力稍差。膜干燥或反复接触：实验过程中要保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。曝光时间过长：可减少曝光时间。 4⃣️ 如何减少杂带？目的蛋白存在多个修饰位点。目的蛋白有其他剪切本。样本处理过程中目的蛋白发生降解（最常见）。上样量过高：适当减少上样量。 5⃣️ 如何解决无信号或信号弱的问题？目标蛋白未提取出来：选用合适的裂解液。目标蛋白表达低：增加上样量。转移不完全或过转移：适当调整转膜的时间和电流。抗体不能识别测试种属的相关蛋白。一抗孵育时间不足：建议4℃结合过夜。二抗与一抗不匹配：选择针对一抗来源的种属的抗体。洗膜过度：缩短洗膜时间。 6⃣️ 其它现象：膜上多处出现黑点或黑斑：抗体与封闭试剂发生非特异性结合，或奶粉未充分溶解粘在膜上。反白（条带显白色）：目的蛋白含量太高或一抗浓度偏高。蛋白分子量偏低或偏高：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

Abmart抗体小样，科研神器！𐟒ꊦœ€近在科研上遇到点小麻烦，I抗体怎么都跑不出来，真是急死人了。后来在网上看到有人推荐Abmart的抗体，说是特别良心，想着试试也无妨。结果，买回来第一次用，1:1000的比例，快封20分钟，结果p-I还是没跑出来。心想这下完了，钱白花了。不过，Abmart的技术人员倒是很耐心，告诉我1:2000的比例用奶粉配抗体，提高上样量，封闭液也用奶粉配，封闭2小时。按照这个方法，结果真的出来了！条带又干净又清晰，简直太惊喜了！关键是，这个抗体还是我买抗体送的小样，硬着头皮去问，技术人员还很有耐心地回答我，真是太感动了。所以，如果你也在科研上遇到类似的问题，不妨试试Abmart的抗体，真的很有帮助！#abmart科研好帮手

WB实验全攻略：从电泳到曝光 ### SDS-PAGE 电泳 𐟌Š 上样准备：首先，用斜插板固定玻璃板，确保底部对齐，避免漏胶。然后，将分离胶灌到适当的高度，可以用梳子测试一下，梳子齿距离分离胶上液面大约7mm为宜。接着，用异丙醇或蒸馏水封胶，静置30分钟。之后，缓慢均匀地加入浓缩胶，直至加满，再加上梳子，等待20分钟后分离胶凝固。电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部，玻璃板内侧液面高于外侧。开始上样，每孔总上样量在20 以内，上样时间要短，避免样品扩散。转膜 𐟔„ 转膜摆放顺序为：阴极碳板+海绵+三层滤纸+胶+膜+三层滤纸+海绵+阳极碳板。将电泳完毕的凝胶取出，放入转膜缓冲液中。采用“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的转膜液浸透过的海绵垫，再各放一块滤纸，凝胶平稳地放在阴极滤纸上。接着，将已经用甲醇激活过的PVDF膜放在凝胶的上方，去除气泡，夹好夹子，将转印夹放入转印槽中。封闭与抗体孵育 𐟧ꊥ𐆨𝬥𐥮Œ的膜放入装有PBST的孵育槽中，快速漂洗一次，然后加入脱脂牛奶，放置脱色摇床上，室温下封闭60分钟。按照抗体说明书，进行一抗稀释，配置好后，倒掉孵育槽中的封闭液，加入配置好的一抗，4℃孵育摇床过夜（摇床慢摇）。回收一抗，用PBST快速洗膜三次，然后加入PBST，放置脱色摇床上快速洗脱，每次10分钟，洗三次。将二抗用PBST按照1:5000的比例进行稀释，然后加入孵育槽中，放置摇床上慢摇，室温下孵育60分钟。 PBST快速洗膜三次，然后再加入PBST，放置脱色摇床上快速洗脱，每次10分钟，洗三次。曝光 𐟓𘊦 𙦍᥸榷𑦵…调整曝光时间。通过以上步骤，你就能完成一次完整的WB实验啦！希望这篇攻略能帮到你。

免疫荧光染色全攻略，轻松上手！ 𐟔젦Š€术简介免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）是一种结合了免疫学、生物化学和显微镜技术的强大工具。通过将抗体与特定的示踪物质结合，利用抗原抗体反应，可以在组织或细胞内定位特定的抗原。这项技术的特点是特异性强、敏感性高、速度快。 ⚠️ 注意事项免疫染色固定液含有对人体有害的多聚甲醛，操作时要特别小心，并做好防护措施，避免直接接触或吸入。此技术仅供专业人员用于科学研究，不得用于临床诊断或治疗，也不能用于食品或药品。为了您的安全和健康，请务必穿实验服并戴一次性手套操作。 𐟑‰ 3D细胞培养免疫染色操作流程 𐟑ˆ 1️⃣ 细胞样本准备 a. 细胞培养：在IBAC⮠S1微孔中使用基质胶进行3D培养，直到细胞生长到合适的状态（建议细胞球直径＞50 ）。 b. 细胞固定：弃除培养基，用PBS清洗3次，然后加入100 的细胞固定液，室温固定20分钟。 2️⃣ 细胞通透和封闭 c. 清洗：用100 移液枪缓慢吸除废液，加入100 的PBS，浸泡10分钟，然后吸除。重复清洗3次。 d. 穿膜（可选，胞内染色需要）：加入100 的穿膜液，室温孵育30分钟。 e. 清洗：重复c步骤，共清洗3次。 f. 封闭：加入100 封闭液，室温孵育1小时。 3️⃣ 抗体孵育 g. 一抗孵育：用一抗稀释液按照抗体说明书的要求稀释抗体至工作液，每孔加入50 ，4℃冰箱孵育过夜或室温孵育1-2小时。 h. 清洗：回收一抗工作液并冻存（-20℃），重复c步骤，共清洗3次。 i. 二抗孵育：用二抗稀释液按照抗体说明书的要求稀释抗体至工作液，每孔加入50 ，室温孵育1-2小时。此后全程避光。 j. 清洗：回收二抗工作液并冻存（-20℃），重复c步骤，共清洗3次。 𐟓 总结通过以上步骤，您可以轻松完成免疫荧光染色，为科研工作提供有力的支持。记得在操作过程中注意安全和防护，确保实验的顺利进行。

WB封闭揭秘：原理作用在Western Blot（WB）实验中，封闭步骤至关重要，它旨在防止抗体非特异性结合到膜上的非目标蛋白或其他分子，从而减少背景干扰，提高实验的特异性和灵敏度。𐟧 𐟔 封闭的原理在WB过程中，蛋白质通过电泳分离后被转移到硝酸纤维素（NC）、聚偏氟乙烯（PVDF）或其他适用膜上。这些膜具有高蛋白结合能力，但也意味着它们可以结合任何可用的蛋白，包括用于检测的抗体。如果不进行封闭处理，抗体可能会非特异性地结合到膜上未被样品蛋白占据的位置，导致高背景信号。 𐟔砥𐁩—�‚的类型封闭液通常包含一种或多种非特异性蛋白或其他大分子，它们可以占据这些潜在的非特异结合位点。常用的封闭剂包括：牛血清白蛋白（BSA）：一种纯净的蛋白，常用于更严格的应用，如磷酸化蛋白的检测。脱脂牛奶：最常用的封闭剂，因成本低廉且富含多种蛋白而广泛使用，但对某些实验（如磷酸化检测）可能引入干扰。非脂蛋白：如鱼胶原或其他商业可用的植物蛋白基封闭剂，适合避免动物源性污染。 𐟚€ 封闭的作用减少非特异性背景：封闭剂通过占据空白位点，阻止抗体非特异性结合，从而降低背景噪音，使条带更清晰。增强特异性信号：有效的封闭可以帮助抗体更专一地结合到其目标蛋白，提高检测的特异性。 𐟒‰ 封闭的操作通常，在膜转移后，将膜浸入封闭液中，在室温或4Ⰳ下孵育一段时间（通常是室温1小时或4℃过夜）。封闭的时间和温度可以根据实验需要和实验室的具体协议进行调整。

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