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反相高效液相色谱新上映_反相高效液相色谱原理是什么(2024年12月抢先看)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：导读更新日期：2024-11-28

反相高效液相色谱

𐟧적DC药物的DAR值解析 𐟔 DAR值，即药物与抗体的比值，是评估ADC药物质量的关键指标。它揭示了抗体上偶联的小分子毒性药物的平均数量，与药效及清除率紧密相关。 𐟒ᠥ𘸧”觚„DAR值分析方法包括紫外-可见分光光度法（UV）、疏水色谱法（HIC-HPLC）、反相色谱法（RP-HPLC）以及质谱法（MS）。 𐟓Š 紫外-可见分光光度法通过测量药物和抗体在特定波长下的吸收值，结合Lambert-Beer原理，计算出DAR值。 𐟌᯸ 疏水色谱法利用高盐体系和梯度洗脱，根据分子疏水性的不同来分离不同载药量的抗体，从而测定DAR值。 𐟒‰ 反相高效液相色谱法则通过还原抗体、解离轻链和重链，并在RP-HPLC柱上分离载药形式，根据峰面积百分比计算DAR值。 𐟔젨🙤𚛦–𙦳•各有优势，共同确保了ADC药物的质量控制。了解这些分析方法，有助于更全面地评估ADC药物的性能。

𐟍즞œ糖与甘油液相分析探秘𐟧슰Ÿ”在食品与饮料分析领域，果糖和甘油是两种备受关注的成分。为了准确测定它们，高效液相色谱法（HPLC）大展身手。𐟍Ž 𐟍쥯𙤺Ž果糖的分析，HPLC能轻松分离并定量粮食、乳制品、果蔬及甜味料中的果糖、葡萄糖、蔗糖等。试样经提取后，通过高效液相色谱柱，再由示差折光或蒸发光散射检测器捕捉信号，外标法助力定量精准。𐟍‡ 𐟧짔˜油的分析同样离不开HPLC。在葡萄酒检测中，甘油与糖类一同被高效液相色谱法捕捉。试样经超声提取，反相色谱柱分离，示差折光检测器再次发挥功效，通过保留时间定性，外标法定量。𐟍𗊊𐟎‰总的来说，HPLC在果糖和甘油液相分析中大放异彩，为食品与饮料检测提供了准确、高效的定量分析手段。𐟎‰

高效液相色谱仪使用必知的12个关键点高效液相色谱仪的使用需要一些关键注意事项，以下是12个实用的建议，帮助你更好地操作仪器：流动相选择 𐟌Š 选择HPLC级或更高级别的流动相。使用前，用0.22um滤膜过滤，并确保瓶盖盖好，推荐使用有排气孔的瓶盖。水纯度 𐟒犤𝿧”褺Œ次蒸馏水或超纯水，现配现用，以避免微生物滋生导致系统污染。流动相温度 𐟌᯸ 流动相配制后，放置至室温再使用，以避免温差导致性能不稳定。缓冲盐的使用 𐟧‚ 使用缓冲盐时，必须过滤，并在使用前后用纯水清洗流路。避免将缓冲盐溶液留在流路中静置。色谱柱先用低比例有机相冲洗，再用高比例有机相冲洗保存，以防缓冲盐析出。避免使用高浓度磷酸缓冲盐（>10mmol/L）。乙腈流动相 𐟚능𐽩‡避免使用纯乙腈作为流动相，以免乙腈聚合引起吸不上液。如非用不可，建议使用棕色瓶存放。特殊流动相 𐟔슥릜‰丙酮、四氢呋喃、浓硫酸、浓硝酸、三氯乙酸、二氯甲烷、四氯化碳、二甲亚砜等溶剂的流动相，不要使用PEEK材料管路。卤素离子溶剂 ⚠️ 含有卤素离子的溶剂会引起不锈钢材料腐蚀，尽量避免使用。如非用不可，分析结束后，应立刻用超纯水冲洗全流路。进样器清洗液 𐟧𜊦 𙦍†析化合物的极性选择合适的清洗溶剂。流动相使用时长 ⏳ 流动相建议最多使用1-2天，避免长时间置于溶剂瓶中。流动相pH 𐟌𑊨€ƒ虑色谱柱的耐受范围，不宜在色谱柱耐受的上下限长期使用，以免影响色谱柱寿命。流动相互溶性 𐟌€ 流动相的使用需考虑互溶性，避免因流动相不互溶而导致缓冲盐析出。反相试剂与正相试剂之间需用异丙醇置换。长期不使用的操作 𐟛 ️ 仪器如长期不用时，应用甲醇冲洗保存。掌握这些关键点，高效液相色谱仪的操作将更加得心应手！

高效液相色谱的7种分离原理详解高效液相色谱（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物化学和药物研究中的分离技术。以下是HPLC的几种主要类型及其分离原理： 𐟌🠥𘩙„色谱法原理：基于物质在固定相上的吸附能力差异进行分离。固定相：通常为极性吸附剂，如硅胶、氧化铝等。流动相：为有机溶剂或混合溶剂。适合化合物：极性化合物，如氨基酸、有机酸等。 𐟔𕠦�‘分配色谱法原理：基于溶质在固定相和流动相之间的正相分配原理，即溶质在固定相上的亲和力大于在流动相上的亲和力。固定相：常采用氰基或氨基化学键合相。流动相：使用非极性或弱极性的有机溶剂，如己烷、苯等。适合化合物：中等极性和极性较强的化合物，如糖、氨基酸、核苷酸等。 𐟔𔠥向分配色谱法原理：基于溶质在固定相和流动相之间的反相分配原理，即溶质在固定相上的亲和力小于在流动相上的亲和力。固定相：通常使用非极性介质，如C8、C18等。流动相：使用水或含有有机溶剂的缓冲溶液。适合化合物：离极性较弱或非极性化合物，如脂肪酸、烃类等。 𐟔‹ 离子交换色谱法原理：基于物质与固定相上离子交换基团的离子交换能力差异进行分离。固定相：为离子交换树脂。流动相：水或含有有机溶剂的缓冲溶液。适合化合物：带电化合物，如氨基酸、多肽、蛋白质等。 𐟒Š 分子排阻色谱法原理：基于分子大小差异进行分离。固定相：为多孔性凝胶。流动相：水或含有有机溶剂的缓冲溶液。适合化合物：生物大分子，如蛋白质、核酸等。 𐟔Œ 离子色谱法原理：基于离子在固定相和流动相之间的电迁移和分配行为差异进行分离。固定相：为离子交换树脂或聚合物。流动相：水或含有有机溶剂的电解质溶液。适合化合物：无机离子和有机离子。 𐟔„ 离子对色谱法原理：通过在流动相中加入与样品离子电荷相反的离子对试剂，使样品离子形成离子对，从而改变其在色谱柱上的保留行为。固定相：为离子交换树脂或聚合物。流动相：水或含有有机溶剂的电解质溶液，并加入离子对试剂。适合化合物：带有相反电荷的离子对，如离子型药物、氨基酸等。

如何应对化学污染物引起的液相柱压上升？在使用高效液相色谱仪时，化学污染物可能会导致液相柱压上升，影响分析结果。以下是几种常见的污染物及其处理方法：保留能力中等的污染物这类污染物会被逐渐洗出色谱柱，表现为宽峰、基线馒头形波动和基线缓慢漂移。强保留的污染物这类污染物一般需要更强的流动相才能洗出，否则会在柱头累积。累积的污染物可能会改变保留时间、引起峰拖尾和峰分叉等问题。严重时，会堵塞填料间隙，导致柱压上升。建议使用合适的溶剂冲洗这些物质，如聚合物柱中的蛋白类污染物可用pH13-14的强碱溶液洗掉，但这种方法不适合硅胶基质色谱柱。预防措施制样时采用SPE固相萃取等方法，预先清除掉色谱柱杀手类的污染物质。连接保护柱。保护柱是分析柱的延伸，填料类型和粒径应与分析柱一致，以最大限度地保护分析柱，同时不影响色谱性能。设计和装填良好的保护柱还能增加分析柱的分离效率。如果保护柱中用不同的填料，应选择比所保护的分析柱保留能力弱的固定相，以截住强保留物质。经常对分析柱进行冲洗维护。故障排除已经累积很多污染物时，用甲醇或乙腈简单冲洗不奏效。推荐以下方法清洗反相柱： 100％甲醇---100％乙腈---75％乙腈/25％异丙醇---100％异丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷，每种溶剂冲洗至少10个柱体积。对于250mm㗴.6mm的分析柱，合适的冲洗流速是1～2mL/min。最后用10柱体积的异丙醇过渡，然后回到原来的流动相体系。对受蛋白类污染的硅胶基质反相柱，纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白质。建议使用含有有机溶剂、缓冲液和酸的配方清洗，如三氟乙酸水溶液和三氟乙酸/丙醇溶液梯度洗来再生。在250mm㗴.6mm的柱子中注入100的三氟乙醇，再生效果良好。清洗硅胶、CN和Diol等正相柱建议方法：先用20柱体积50:50正己烷/氯仿冲洗，然后用甲醇、二氯甲烷或100%醋酸乙酯冲洗。对油脂类物质，可用异丙醇清洗。通过以上方法，可以有效应对化学污染物引起的液相柱压上升问题，保证色谱分析的准确性。

高效液相色谱法（HPLC）原理与应用详解高效液相色谱法（HPLC）是一种重要的色谱分析技术，广泛应用于化学、医学、工业、农学、商检和法检等领域。它以液体为流动相，通过高压输液系统将不同极性的溶剂或混合溶剂泵入装有固定相的色谱柱，实现对试样的高效分离和分析。 𐟔 样品注入首先，将待分析的样品通过注射器注入到色谱系统中。这个过程是整个分析过程的第一步，也是最重要的一步。 𐟌Š 流动相样品在流动相（通常是液体）中移动，流动相的组成和流速会影响分离效果。选择合适的流动相是关键，因为它决定了样品在色谱柱中的行为。 𐟏ž️ 分离过程样品在色谱柱中与固定相（通常是固体或涂覆在固体上的液体）发生相互作用。不同组分与固定相的相互作用力不同，导致它们在柱中的移动速度不同，从而实现分离。 𐟕𕯸‍♂️ 检测分离后的组分通过检测器（如紫外检测器、荧光检测器等）进行检测。检测器会记录每个组分的浓度和保留时间，这是数据分析的基础。 𐟒𛠦•𐦍†析通过计算机软件对检测器输出的数据进行分析，生成色谱图，进一步分析各组分的性质和浓度。这个过程是整个分析过程中最智能和最具价值的一部分。 𐟓Š 应用及领域分离混合物：HPLC能高效分离各种混合物，包括有机化合物、无机化合物、生物大分子等。定量分析：通过测量峰面积或峰高，可以对样品中的各组分进行定量分析。纯度检测：HPLC可以用于检测样品的纯度，通过比较样品峰与标准品的峰，可以确定样品的纯度。结构鉴定：通过与其他技术如质谱联用，可以推断出样品的分子结构。 𐟔砦𕋨᤻𖊨䇯𜚈PLC色谱仪（如Waters2695）色谱柱：C18反相柱（250*4.6mm，3um）检测器：UV紫外检测器柱温：25Ⱒ„ƒ 流速：1.0ml/min 进样量：10微升检测波长：254nm 色谱条件：A相为0.32%庚烷磺酸钠+0.136%KH2P04水溶液，B相为乙腈 𐟓Š 结果展示样品信息：样品名称、采集者、样品类型、瓶号、采集方法等。处理过程：处理方法、处理时间、运行时间等。数据分析：浓度和保留时间等数据。报告方法：报告用户、项目名称、打印日期等。 HPLC是一种强大的分析工具，能够提供精确的化学信息，帮助科学家和工程师更好地理解物质的性质和行为。

多肽从三氟乙酸盐到醋酸盐的转换指南在多肽合成和药物制剂中，将多肽从三氟乙酸盐（TFA盐）转换为醋酸盐是一个常见的步骤。这个过程通常通过高效液相色谱（HPLC）技术来实现，以下是详细的步骤说明： 𐟔 基本原理三氟乙酸（TFA）是一种强有机酸，常用于多肽合成的脱保护步骤。然而，由于其酸性强，可能会引起一些不必要的副作用。醋酸盐则是一种较弱的有机酸盐，通常具有较好的生物兼容性，因此在药物制剂或生物实验中更为合适。 𐟛 ️ 转换过程选择合适的柱子离子交换通常使用离子交换树脂填充的柱子，这些柱子能够根据离子的电荷和大小进行选择性交换。样品准备将含有TFA盐的多肽溶液准备好，确保溶液的浓度和纯度符合实验要求。上样将准备好的样品注入到HPLC系统中。HPLC系统能够精确地控制流动相的速度、压力和温度，以确保离子交换的高效进行。流动相选择使用适当的缓冲液作为流动相，如醋酸铵溶液。醋酸铵能够提供醋酸根离子，与TFA盐中的阳离子进行交换。洗脱当样品通过柱子时，TFA盐会与醋酸铵发生离子交换反应，形成醋酸盐形式的多肽。这一过程中，HPLC系统能够实时监测洗脱液的成分和浓度，以确保转换的完全性。收集收集洗脱下来的醋酸盐形式的多肽。根据需要，可以对收集到的多肽进行进一步的纯化和浓缩处理。后处理根据实验要求，对收集到的醋酸盐形式的多肽进行必要的后处理，如去除溶剂、调整pH值等。 𐟓 注意事项在进行离子交换过程中，操作者应具备一定的HPLC操作经验，以确保实验的成功进行。转换过程中应严格控制实验条件，如温度、pH值、离子强度等，以避免对多肽的活性产生不良影响。收集到的醋酸盐形式的多肽应进行充分的鉴定和表征，以确保其纯度和活性符合实验要求。 𐟓‹ 操作示例将C18反相柱用50%以上的乙腈溶液冲洗20-30min，除去碳柱和管道中残留的TFA。纯水冲洗碳柱，防止高浓度的醋酸铵溶液脱盐时，醋酸铵固体析出。用95%醋酸铵溶液和5%乙腈冲洗15-30min进行脱盐。用0.1%冰醋酸进行梯度洗脱，收集化合物峰。冷冻干燥液体得到化合物。通过以上步骤，多肽可以从三氟乙酸盐（TFA盐）成功转换为醋酸盐形式，以满足不同应用场合的需求。

蜂王浆是哺育蜂咽下腺和上颚腺等腺体的分泌物,是一种天然的功能性食品。蜂王浆成分复杂,主要包括水、蛋白质、脂类、氨基酸、糖类、维生素等,其丰富的生物活性成分是蜂王浆具有抗肿瘤、抗衰老等医疗保健功效的基础。为提高蜂王浆产量,我国从意大利蜜蜂(意蜂,Apis mellifera ligustica)中培育出了蜂王浆高产蜜蜂(浆蜂),并尝试通过改变移虫后的取浆时间来提升蜂王浆品质。已有研究报道了蜂王浆产量和取浆时间对蜂王浆总蛋白和10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)等成分含量的影响,但仍存有分歧,而且对其他小分子成分的影响尚不清楚,制约了蜂王浆品质的总体评价。本课题旨在利用基于超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)的非靶向代谢组学技术,比较浆蜂和意蜂在移虫后24 h、48 h和72 h生产的蜂王浆小分子化合物的组成和含量,解析蜂王浆产量和取浆时间对蜂王浆小分子成分的影响,并比较蜂王浆含水量和抑菌活性,从整体上判断蜂王浆的品质,确定最佳的取浆时间,为我国蜂王浆优质高效生产提供依据。为优化蜂王浆代谢物的提取方法,分别使用浓度分别为50%和80%的3种溶剂(甲醇、乙醇和乙腈)提取蜂王浆代谢物,运用UPLC-HRMS进行检测。发现80%甲醇或80%乙醇组得到的代谢特征离子数量更多,而80%乙腈组最少且重复性最差。已鉴定的中低极性物质在50%溶剂组丰度较低,强极性物质在80%乙腈组丰度最低。因此,80%甲醇或80%乙醇是提取蜂王浆代谢物的最佳溶剂。通过浆蜂和意蜂3个取浆时间的蜂王浆代谢组学分析,鉴定了77个高丰度小分子化合物。与意蜂相比,浆蜂蜂王浆不仅产量提高了9倍,而且主要活性成分的含量差异不显著,其中72 h蜂王浆的10-HDA(1.98%)和水分平均含量(67.26%)均符合我国优质蜂王浆的国家标准,抑菌活性也未发生显著变化,以上结果表明浆蜂蜂王浆在产量显著提高的同时,仍然保持了优良的品质。浆蜂移虫后24 h蜂王浆的平均含水量显著下降(58.57%),10-HDA、乙酰胆碱、牛磺酸等活性成分含量显著升高,因而具有更高品质,但由于产量显著降低且耗费劳动力,不利于蜂王浆生产。移虫后48 h和72 h的蜂王浆代谢谱高度一致,含水量和产浆量均无显著差异,但48 h生产方式的移虫数量比72 h增加50%,更耗费劳动力,所以72 h优于48 h取浆。本研究首次将反相液相色谱(RPLC)和亲水相互作用色谱(HILIC)两种分离方法分别联合高分辨质谱技术,进行蜂王浆非靶向代谢组学分析。优化了蜂王浆代谢物提取方法,为后续蜂王浆代谢组学研究提供了技术支持;阐明了浆蜂蜂王浆优质高产的特性,揭示了移虫后收取蜂王浆的最佳时间,为蜂王浆优质高效生产提供了科学依据。