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细胞转染最新视觉报道_细胞转染原理(2024年11月全程跟踪)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：热点更新日期：2024-11-27

细胞转染

上一期内容介绍了如何构建质粒，然而成功构建质粒只是踏出了基因表达调控的第一步，要成功调控基因表达，还需要将质粒高效的递送到细胞内。本期小编将向大家介绍如何将质粒转染进宿主细胞。广义上讲，转染是利用病毒感染以外的方式人工将核酸（DNA或RNA）导入细胞的过程。经过转染后，导入的核酸游离在细胞核中，可转录表达而不进行复制，也有极小部分会整合到受体细胞的基因组中，随宿主基因组一同复制。作为最常见的转染载体，质粒DNA含有重组基因和调控元件，可以转染到细胞中，用于基因表达调控，研究基因的功能、基因产物的突变分析和生化表征以及基因表达对细胞健康和生命周期的影响。对哺乳动物细胞转染来说，除了合适的载体，转染方法和转染试剂对转染的成功率也起到决定性作用。「汉恒生物」「科研」「质粒转染」「质粒构建」

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Transwell实验详解，测侵袭！体外Transwells小室趋化侵袭实验——24孔趋化小室(孔径8um) 𐟔 实验原理在Transwell实验中，上室种植肿瘤细胞，下室加入FBS或特定趋化因子。肿瘤细胞会向营养成分高的下室移动。与肿瘤细胞迁移实验不同，此实验在上室侧铺上一层基质胶，模拟体内细胞外基质。细胞欲进入下室，需先分泌基质金属蛋白酶（MMPs）降解基质胶，才能通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。 𐟓 实验方法大致流程 1️⃣ 将冻存的Matrigel胶在4℃冰箱中过夜解冻，使其液态化。 2️⃣ 用不含10%胎牛血清的RMPI1640培养液稀释Matrigel胶，按1:1的比例在冰水浴中混匀。 3️⃣ 将稀释后的Matrigel胶均匀铺在聚碳酸酯膜上，覆盖整个膜面，置入37℃恒温箱中静置30min-1h使其凝固形成基质屏障胶。 4️⃣ 将转染后收集的细胞或对照组细胞进行常规胰酶消化、PBS冲洗3遍。 5️⃣ 用不含10%胎牛血清的完全培养液重悬细胞，进行细胞计数并调整细胞密度至2.5㗱0^5个/mL。 6️⃣ 将形成基质屏障胶的膜用不含10%胎牛血清的RMPI1640培养液进行浸润水化。于上室加入处理后的细胞，24孔板小室一般加200⵬。 7️⃣ 在下室内加入含有20%优质胎牛血清的RMPI1640培养液进行细胞侵袭诱导，每个组设3个平行复孔。 8️⃣ 将小室在37℃、5%的CO2恒温培养箱中培养24h后，倒弃上室中的细胞及液体，并用PBS冲洗2遍。 9️⃣ 将上室内的Matrigel基质屏障胶用棉签擦去，滤膜上层贴壁生长但未能穿过膜的细胞。将上室置于95%乙醇室温固定30min。 𐟔Ÿ 将固定后的膜经结晶紫染色10~15min后，蒸馏水冲洗终止染色。 1️⃣1️⃣ 显微镜下随机挑选5个低倍视野(200X)的细胞计数，以其穿膜细胞的平均数作为细胞侵袭能力的参数，计算平均值。通过以上步骤，你可以评估肿瘤细胞的侵袭能力，进一步了解肿瘤细胞的生物学特性。

质粒提取常见问题解答𐟌€𐟌€ 在质粒提取过程中，我们可能会遇到各种问题。以下是一些常见问题的解答：如何确定质粒小抽的细胞用量？⬇️ 在一般的载体构建实验中，几微克的DNA就足够了。因此，小提5ml菌液通常能满足需求。如果使用过多的细胞，由于试剂盒的限制，可能会导致菌液难以裂解，而且DNA的纯度和得率也不会显著提高。对于需要大量质粒的情况，可以考虑更换提取试剂盒或按比例增加各溶液的用量。电泳分析抽提的质粒会看到什么？𐟌Š 如果质粒的纯度很差，电泳加样孔往下看到的条带依次是基因组DNA、开环环状质粒、超螺旋质粒、变性的超螺旋质粒和细菌RNA。高质量的质粒胶图主要部分为超螺旋质粒，没有RNA等污染。质粒制备的得率由哪些因素决定？𐟌𑊨𔨧𒒧š„得率受多种因素影响，包括宿主细胞类型、大肠杆菌的数量、质粒的拷贝数和提取过程中使用的纯化方式（试剂盒类型）。质粒需要什么样的纯度？𐟔 对于一般的载体构建和测序检测，手工和试剂盒制备的DNA就能达到要求。但如果质粒用于细胞转染实验，则需要无热源、无内毒素的质粒。为什么酶切鉴定“有插入片段”的质粒测序却发现是空的？✂️ 主要原因是在提取质粒的过程中产生了变性的超螺旋质粒，限制性内切酶无法对其进行酶切。因此在判断酶切效果时，变性的超螺旋质粒常被误认为是酶切下来的片段，从而导致误判。可以通过在酶切后的电泳分析中增加一个原始质粒进行对照来避免误判。如何判定DNA的纯度和浓度？𐟓 使用试剂盒抽提的质粒DNA，可以通过仪器检测OD260和OD280浓度，通常OD260/OD280的比值在1.7-1.8之间。1 OD260=50/ml。如果要估算质粒浓度，建议通过琼脂糖电泳来判断会更准确一些。为什么有些纯化的质粒时间长了会发生降解？⏳ 主要原因可能是核酸酶的污染。除了在质粒提取过程中带入核酸酶外，质粒宿主细胞的种类也会影响到抽提质粒的质量。如果提取的质粒需要长期保存，可以使用内含丰富核酸酶活性的大肠杆菌，如DH5€DH1等。

实验室“打工人”必备高级仪器中英文名 𐟔쥜襮ž验室里，科研人员需要使用各种仪器设备来完成实验。今天我们整理了一些高级实验室仪器设备的中英文名称，虽然它们的使用频率可能不如试剂和耗材高，但同样不可或缺！自动移液器：Automated liquid handler 原子吸收光谱仪：Atomic absorption spectrometer 96孔分离器：96-well separator 毛细管电泳系统：Capillary electrophoresis system 4D-细胞核转染系统：4D-Nucleofector system 自动细胞计数仪：Automated cell counter 厌氧室：Anaerobic chamber 高压灭菌器：Autoclave machine 空气采样器：Air sampler 这些仪器设备在实验室中扮演着重要角色，帮助科研人员更高效地进行实验。