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质粒转化最新视觉报道_质粒的四个基本特征(2024年12月全程跟踪)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：热点更新日期：2024-11-29

质粒转化

GST-pull down实验全攻略𐟓– 今天给大家介绍一种超实用的GST-pull down实验！这可是研究蛋白质相互作用的好方法哦𐟧。 𐟑‰实验原理： GST-pull down实验利用谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合的蛋白质（诱饵蛋白）与谷胱甘肽亲和树脂结合，从而捕获与之相互作用的蛋白质（捕获蛋白）。下面是具体步骤𐟑‡： 𐟌Ÿ蛋白表达与纯化：将GST标签的质粒转化到大肠杆菌（如BL21感受态细胞）中。诱导表达GST融合蛋白，收集细菌。用超声破碎细菌，收集含有GST融合蛋白的细胞裂解液，然后用谷胱甘肽亲和层析纯化GST融合蛋白。 𐟌Ÿ实验设计：设计实验组和对照组，实验组用GST-诱饵蛋白，对照组用单独的GST蛋白。蛋白质量要合适，一般500的诱饵蛋白GST-A即可。 𐟌Ÿ孵育与结合：将纯化好的GST融合蛋白与谷胱甘肽珠子在4Ⰳ孵育数小时，确保充分结合。将珠子和含有潜在互作蛋白的细胞裂解液或纯化的蛋白质溶液混合，在4Ⰳ过夜孵育。 𐟌Ÿ洗涤与洗脱：用预冷的PBS或特定洗涤液洗珠子，去除未结合的蛋白质。用含有不同浓度还原型谷胱甘肽的洗脱液洗脱结合的蛋白质复合物。 𐟌Ÿ检测与分析：通过Western blot或质谱（MS）分析洗脱的蛋白质，验证蛋白质之间是否有相互作用。还可以用考马斯亮蓝染色或Silver staining评估纯化蛋白的量和纯度。 𐟌Ÿ结果解读：如果实验组检测到预期的互作蛋白，而对照组没有，说明GST融合蛋白和互作蛋白之间有特异性相互作用。注意：GST-pull down实验虽然简单、快速有效，但通常还需要共免疫沉淀（Co-IP）等实验来验证细胞内蛋白质相互作用是否真实存在𐟤—。

一、GST/His-a融合蛋白的表达 (1)将目的蛋白与GST/His的重组质粒转化到BL21菌株中； (2)挑取单克隆到含有5 ml LB培养基（加入5 氨苄）的10 ml试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜； (3)将培养菌液转移到含有500 ml LB（含500 氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200 rpm培养数小时； (4)测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，200rpm条件下培养10-16 h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）； (5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50 ml离心管中，4℃ 4000 rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中； (6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10 min后弃去上清，再按每10 ml菌液沉淀1 ml PBS的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中； (7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。每次超声破碎20 s，间隔30 s（破碎时间、破碎次数和间隔时间视具体情况而定），经过适当时间超声后，溶液会显得澄清； (8)将超声后的溶液4℃ 4000 rpm离心10分钟，上清液转移至新的离心管中，-80℃保存备用。二、GST/His-a融合蛋白的纯化 (1)在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积磁珠，4℃摇床上缓慢摇动30~60 min; (2)4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，该磁珠上结合了GST/His-a融合蛋白； (3)加入500 预冷的PBS溶液，轻晃悬浮珠子，将磁珠洗涤一次，4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，重复此步骤3次； (4)最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST/His-a的磁珠。关于凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）,如有相关科研问题，欢迎留言探讨。 #科研学习#⠂ #研究生日常#⠂ #泛素化修饰#⠂ #实验室日常#⠂ #EMSA#

𐟔젦„Ÿ受态细胞的多样性选择与使用指南 𐟓– 感受态细胞1.1每支来自喀斯玛锐竞，提供100/支，适用于多种菌种，包括DH5€Top10、JM109、Stbl3和BL21等。选择合适的感受态细胞对于基因克隆实验至关重要，以下是详细的使用感受和步骤： 𐟔 选择适宜的感受态细胞：根据序列的结构、长度、载体种类以及特殊要求等，选择合适的感受态细胞。例如，DH5’ŒTOP10适用于蓝白斑筛选、高效克隆和质粒抽提；JM109是甲基化酶缺陷型；DH10B适用于文库构建、长片段质粒克隆和150bp质粒转化；Stbl3适用于克隆不稳定插入片段、正向重复和逆转录病毒序列；Stbl4则适用于克隆甲基化基因组序列。 𐟔砥“转化实验步骤：取100冰上融化的感受态细胞，加入目的DNA（质粒或连接产物），轻轻混匀后冰上静置30分钟。将混合物在42℃水浴中热激45-60秒，迅速转移至冰浴中，静置2分钟。注意在冰上静置过程中不要晃动样品，以免降低转化效率。向离心管中加入700不含抗生素的无菌液体培养基（SOB或LB），混匀后37℃、200rpm复苏60分钟。根据实验需要，取合适体积的复苏液均匀涂布到含相应抗生素的SOB或LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。通过以上步骤，您可以选择合适的感受态细胞进行基因克隆实验，确保实验的成功和准确性。

PEG揭秘：酵母转化关键酵母转化过程中，PEG（聚乙二醇）以其独特的性质扮演着重要角色。𐟌 PEG是一种高分子聚合物，其分子量对酵母转化的效果有着显著影响。通常，分子量约为3000的PEG能够最有效地促进转化。 PEG在酵母转化中的主要作用包括：在高浓度的LiAc（锂乙酰）环境中保护细胞膜，减少LiAc对细胞膜结构的损伤；同时，PEG还能促进质粒更紧密地附着在酵母细胞壁上。𐟛᯸ PEG的分子量范围广泛，从300g/mol到200000g/mol不等，不同分子量的PEG在工业、医药和化妆品等领域有着各自特定的应用。𐟏�𞋥悯𜌐EG 400、PEG 600、PEG 1000等，这些数字代表的是聚合物的平均分子量。值得注意的是，50%的PEG溶液不宜进行高压灭菌，因为高压会导致PEG分子断裂，从而影响转化效率。𐟚렦�ᮧš„处理方式是过滤除菌，以确保转化过程的顺利进行。通过这些细节，我们可以看到PEG在酵母转化中的重要作用，以及其在不同领域中的广泛应用。𐟌ˆ

质粒转化实验全攻略：从准备到提取质粒的转化实验主要包括三个部分：感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和质粒DNA的提取。以下是详细的步骤：（Ⅰ）感受态细胞的制备从活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。将菌悬液按照1:100的比例转接到100ml液体培养基中，37℃振荡扩大培养，2~3小时。当培养液开始浑浊时，间断性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。将培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20分钟，0℃-4℃离心10分钟（4000r/min）。弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30分钟。（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率） 4℃离心10分钟（4000r/min）。弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。可直接用于实验，4℃保存。也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。（Ⅱ）质粒DNA的转化取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入1ul质粒DNA混匀，同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最后一点冰融化后，迅即加入DNA。若解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。冰浴30分钟，离心管放到42℃保温90秒（不要摇动离心管）。冰浴时间短于30分钟，可能影响转化率。然后迅速冰浴2分钟。向离心管加800ul LB液体培养基，37℃振荡培养1小时（150r/min）。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最佳效果。取适当（50ul）的复苏细胞培养液，涂布在含抗性的选择性培养基上，将培养皿放置在37℃恒温培养箱中，正置30分钟。等菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中，培养12~16小时，出现菌落。菌落结果：无菌落：失败或者培养条件不充分。布满菌落：呈苔样，失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致。布满菌落：浓度太高，失败。出现菌落：符合要求。（Ⅲ）质粒DNA的提取质粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒，实验操作简单，只需按照产品操作说明操作即可。

𐟧전H5ˆ𖥤‡的魔法原理 𐟔 想要了解DH5ˆ𖥤‡的神奇原理吗？那就跟我一起来探索吧！ 𐟌𑠥œ谢„ƒ的条件下，利用钙离子作为媒介，大肠杆菌在CaCl₂低渗溶液中会膨胀成球形，细胞膜的通透性也会因此增加。 𐟒𜠨𝬥Œ–混合物中的质粒DNA与钙离子携手，形成一种坚韧的羟基-钙磷酸复合物，这个复合物能粘附在细菌细胞表面，大大提高了DNA进入细胞的几率。 𐟔堦Ž夸‹来，通过42℃的短暂热击处理，可以促进细胞对DNA复合物的吸收，让转化更加高效。 𐟌᯸ 热击后，感受态细胞被放入无抗性的液体培养基中，在37℃下孵育和复苏。这样，转入的外源DNA所携带的筛选标记等基因就能得以表达，产生抗性，比如对氨苄青霉素的抗性。 𐟎‰ 最后，将复苏后的大肠杆菌涂布在带有抗性的固体筛选培养基平板上进行筛选，就能得到我们心仪的DH5•毼 ✨ 通过这个过程，我们可以制备出转化率高达5㗱06～2㗱07转化子/质粒DNA的DH5„Ÿ受态细胞，满足各种基因克隆试验的需求。 𐟒ᠦ˜露是觉得这个过程既神奇又有趣呢？那就赶快试试吧！

质粒转化全攻略：关键步骤与注意事项 1. 从-80℃和-20℃分别取出感受态细胞和质粒，置于冰上解冻。 𐟒™ 若质粒为冻干粉末，可用无菌水或TE buffer稀释至100ng/ul。 𐟒™ 感受态细胞刚溶解时转化效率最佳，建议不超过3分钟。 2. 取1-10ul质粒，轻轻加入到感受态细胞中，轻拍管底或用枪头轻轻搅拌混匀。 𐟒™ 注意不要吸打，以免损伤感受态细胞。 𐟒™ 质粒体积小于感受态细胞体积的1/10。 3. 在冰上孵育30分钟。 𐟒™ 目的是克服质粒和感受态细胞表面的负电排斥作用，使质粒吸附到感受态表面。 𐟒™ 此时可预热水浴锅。 4. 42℃热激45秒。 𐟒™ 时间不要过长，温度不要过高。 𐟒™ 目的是使细胞膜上打开孔隙，让质粒进入细胞。 5. 迅速冰上放置2分钟。 𐟒™ 注意不要晃动。 𐟒™ 目的是使打开的孔隙关闭。 6. 加入700ul左右不含抗生素的LB，37℃，220rpm振荡1小时。 𐟒™ 时间可根据质粒转化效率适当调整。 𐟒™ 盖子不要拧太紧。 7. 5000rpm离心5分钟，弃去部分上清，剩余约200ul上清重悬菌体，取10ul或全部涂布于平板。 𐟒™ 可用一次性无菌涂布棒，减少污染。 𐟒™ 如果质粒转化效率高，或不要求菌体数量，可不离心直接取50-200ul涂布。 8. 37℃或室温静置至菌液被吸收，然后倒置过夜培养（37℃，12-16小时）。 𐟒™ 不要超过16小时。最佳时间为12-14小时，时间太长可能出现卫星菌落。 𐟒™ 次日可挑大且圆润的单菌落摇菌进行后续实验。

影响根癌农杆菌介导香蕉胚性悬浮细胞遗传转化的因素都有哪些？ ? 前言 ? 目前国内外就香蕉的遗传转化开展了一定的工作,通过基因枪法或根癌农杆菌介导法获得了少数几个香蕉品种转基因植株,但由于香蕉单细胞起源的高效再生体系非常难以建立,导致基因工程在香蕉上取得的成功非常有限。 ? 我国学者前期以分化芽茎尖和茎尖薄切片等组织为转化受体探讨了早期遗传转化参数和再生的研究，但该再生途径为多细胞起源,得到的转基因植株多为嵌合体,在筛选的过程中容易出现性状的丢失。 ? 农杆菌菌株与质粒 ? 根癌农杆菌菌株为EHA105,植物表达载体 pCAMBIA1301,含有葡萄糖苷酸酶基因(GUS)和潮霉素抗性基因(HYG)。取菌液接种于YEP+Kan 50 mg/L的培养基中, 在28℃、220 r/min条件下振荡培养至D600 nm为0.8～ 1.0。 ? 将培养好的菌液在4℃、5 000 r/min条件下离心 5 min,弃上清,用农杆菌液体培养基洗涤1次,再加入重悬液用于转化。 ? 培养基及培养条件 ? 胚性细胞悬浮培养基MS基本培养基+ 1 mg/L 2,4-D+1 mg/L生物素+100 mg/L谷氨酰胺 +100 mg/L麦芽提取物+45 g/L蔗糖,p H 5.3。 1.4.2重悬菌液培养基MS液体培养基+AS(ace tosyringone)100ol/L。 ? SH培养基中的大量元素和微量元素及其铁盐+ MS维生素+1 mg/L生物素+100 mg/L谷氨酰胺+ 230 mg/L脯氨酸+100 mg/L麦芽提取物+1 mg/L NAA+0.05 mg/L玉米素+108/L Kinetin+0.2 mg/L 2-ip+10 g/L乳糖+45 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉+AS (acetosyringone)100ol/L,pH 5.8。 ? 以上培养基均在121℃条件下灭菌15 min,悬浮培养,体胚的诱导和成熟在(28ⱱ)℃、黑暗条件下进行。胚性细胞悬浮培养保持在持续110 r/min 的旋转摇床上进行。 ? 菌液浓度对根癌农杆菌转化的影响 ? 大量实验证明,农杆菌菌液的浓度和农杆菌细胞的生长状态是转化成功的关键因素,为此,我们采用处于对数期的农杆菌来进行香蕉胚性细胞的遗传转化因素的探讨。 ? 根据图中得知，农杆菌菌液浓度在D6 00 nm0.2时,瞬时表达率最高为13.42%。随着D6 00 nm值的升高,瞬时表达率反而降低。当菌液浓度达到D6 00 nm1.0时,瞬时表达率下降至3.06%。 ? 可见农杆菌菌液浓度对香蕉胚性细胞的转化具有重要影响。如果农杆菌菌液浓度过高,菌体自身容易聚合在一起而不利于外源基因的介导,并且会造成大量细胞的褐化死亡。 ? 当菌液浓度比较低时,转化效果比较好,可能是因为悬浮细胞表面能够和根癌农杆菌菌体相结合的敏感部位比较多,从而在低浓度时就可以进行较高的瞬时表达。 ? 共培养时间对根癌农杆菌转化的影响 ? 农杆菌和外植体的共培养在整个转化过程中是非常重要的环节,因为农杆菌附着、T-DNA的转移及整合都在共培养时间内完成。香蕉悬浮细胞与农杆菌共培养1、2、3、4 d后均没有检测到GUS的瞬时表达,在第5天时开始出现GUS的瞬时表达。 ? 到第8天时,瞬时表达率最高,达20.73%。第9天后开始显著降低。因为农杆菌的过度生长抑制了植物细胞的生长,导致转化的瞬时表达率下降。 ? 侵染时间对根癌农杆菌转化的影响 ? 农杆菌菌液和悬浮细胞分别侵染10、20、30、40 min的瞬时表达率,当侵染时间为10 min时,瞬时表达率最高为25.30%。随着侵染时间延长至40 min时,瞬时表达率下降为10%左右。 ? 可能是因为细胞在菌液中浸泡时间过长,农杆菌毒害而使细胞缺氧,造成瞬时表达率下降。另外,还会引起共培养阶段农杆菌的过度生长,难以用抗生素来抑制,导致细胞变褐死亡。 ? ?结论 ? 综上所述，处于对数期的贡蕉悬浮细胞作为转化受体, 根癌农杆菌浓度D6 00 nm为0.2时,与悬浮细胞进行侵染,在室温、8 000 r/min离心5 min,然后在110 r/min的旋转摇床上摇5 min,在体细胞胚诱导培养基上共培养8 d,瞬时表达率达可以达到最高值 25.30%。

𐟔즞„建质粒载体的详细指南𐟧슰ŸŒˆ质粒载体的选择：首先，选择一个具备合适限制性酶切位点的质粒载体，这些位点将用于将插入片段整合到多克隆位点中。确保插入片段中不存在这些酶切位点，以避免片段被切开。 𐟌ˆ获取插入片段：DNA可以通过提取任何细胞或组织样品获得，或者通过PCR扩增。 𐟌ˆ酶切反应：扩增完成后，使用限制性内切酶对片段和载体进行酶切。 𐟌ˆ纯化质粒和片段：酶切后，通过电泳分离片段和载体，并使用凝胶纯化回收它们。 𐟌ˆ连接DNA片段：使用DNA连接酶将插入片段连接到质粒中。连接反应中，插入片段与载体的最佳比例为3:1，以确保少量载体自连。连接反应可以在14-25℃下孵育1小时或过夜。 𐟌ˆ转化细菌：通过热激法将连接后的质粒转化到细菌中，并将转化后的细菌涂抹在含有抗生素的琼脂板上，在37℃环境中培养过夜。由于质粒包含抗生素抗性基因，成功转化的细菌在抗生素存在下会生长形成菌落。 𐟌ˆ筛选克隆：从转化板中挑选多个单克隆，接种到含有培养基且已编号的管中，在摇床培养箱中进行扩增，并纯化质粒。 𐟌ˆ鉴定质粒：使用限制性酶切割质粒，并将酶切产物进行凝胶电泳，以检查插入片段的存在。证实转化了插入片段的质粒可用于扩大培养和测序。 𐟑颀𐟔쥜覕𔤸꨿‡程中，每个步骤都需要严格控制条件和操作规范，否则可能导致失败。只要按照这个流程认真操作，相信大家都能成功构建质粒载体！

洋葱表皮BiFC实验全流程详解 𐟧젂iFC实验方法主要分为三大类，根据实验材料的不同：烟草叶片：构建载体→农杆菌转化-注射烟草叶片→激光共聚焦显微镜观察洋葱表皮：载体构建→农杆菌转化法/基因枪法→激光共聚焦显微镜观察原生质体：构建载体→制作原生质体+转化质粒→激光共聚焦显微镜观察 𐟌𑠦œ즜Ÿ重点介绍以洋葱表皮（基因枪法）为实验材料的具体流程：材料准备：将洋葱的内层鳞片切成1-2cmⲧš„小块，用镊子撕取内表皮细胞层，光滑面向上，平铺于MS平板的中心区域，预培养4小时备用。金粉准备：称取60mg金粉放入1.5mL的EP管中，加入1mL无水乙醇，涡旋振荡1-2分钟，冰上静置5分钟后，10000rpm离心1分钟，去上清。重复清洗三次后，加入1mL无菌去离子水，涡旋振荡1-2分钟，冰上静置5分钟，室温10000rpm离心1分钟，去上清。最后按50每份分装到已灭菌的1.5mL EP管中备用。 DNA包裹金粉微粒：将DNA与金粉微粒混合均匀。基因枪轰击：将载体膜、可裂膜、阻拦网等置于70%乙醇中1分钟，灭菌滤纸上自然风干。气瓶调节压力到1300psi，取8-9已用DNA包裹好的微粒悬浮液加到微粒载体膜中央，稍微晾干后马上进行轰击。将可裂膜、阻拦网、涂有微粒载体膜安装进固体装置中，射击参数为：轰击微粒运行距离为12cm，压力1110psi，真空度25mmHg。轰击结束后的材料转移到MS培养基中培养24小时。使用激光共聚焦显微镜488nm波长激发下，观察荧光信号。 𐟎‰ 实验完成后，你将能够观察到荧光信号，从而了解基因表达和蛋白质互作的情况。

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