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dtt分子量权威发布_dtt分子量大小(2024年12月精准访谈)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：观点更新日期：2024-12-01

dtt分子量

SDS-PAGE蛋白电泳实验关键因素解析 𐟌 SDS-PAGE蛋白电泳是一种重要的生物化学技术，用于根据蛋白质的分子量大小进行分离。它依赖于SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂的作用，将蛋白质分子解聚，并在碱性缓冲系统中进行分离。 𐟔젥ꌥŽŸ理： SDS-PAGE电泳的原理在于SDS和还原剂的作用。SDS是一种阴离子去污剂，能够破坏蛋白质分子的二级和三级结构，使其去折叠。强还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在100℃保温3～5分钟后，SDS与蛋白质充分结合，形成带负电的蛋白质-SDS胶束。这些胶束的长轴长度与蛋白质的分子质量大小成正比，因此电泳迁移率主要取决于分子质量，而非电荷。 𐟧ꠥꌨ🇧苯𜚊样品准备：将蛋白质样品与SDS和还原剂混合，加热至100℃保温3～5分钟，使SDS与蛋白质充分结合。凝胶制备：将聚丙烯酰胺凝胶放入电泳槽中，加入缓冲液。电泳：将处理后的样品加入凝胶，在恒定电压下进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。结果分析：根据蛋白质条带的位置和强度，分析蛋白质的分子量大小和表达情况。 𐟔„ 影响实验结果的关键因素： SDS浓度：SDS的单体浓度是关键，低于0.5mol/L可能导致蛋白质与SDS的结合不充分，影响电泳效果。还原剂：强还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，从而提高蛋白质与SDS的结合效率。温度和时间：加热至100℃并保温3～5分钟，确保SDS与蛋白质充分结合。 𐟓Š 通过SDS-PAGE蛋白电泳，可以实现蛋白按照分子量大小进行分离的目的。了解这些关键因素，有助于优化实验条件，提高实验结果的准确性。

5个技巧搞定大分子蛋白WB图！如果你在研究大分子量蛋白（超过150KD），发现Western-blot总是跑不出漂亮的图，那么这篇文章一定对你有帮助！大分子量蛋白的提取通常比较困难，因为它们通常是膜蛋白，属于非可溶性蛋白，表达量也较低。使用溶液法（如RIPA）裂解时，这些蛋白往往会丢失在不可溶组分中。因此，选择合适的方法进行蛋白提取或富集至关重要。以下是五个关键步骤，帮助你跑出漂亮的大分子蛋白WB图：选择合适的凝胶 𐟧𔊔ris-Glycine凝胶的pH为8.6，但保质期较短，且在跑胶过程中pH会上升至9.5，这会导致蛋白降解和低分辨率。 Bis-Tris凝胶的pH为6.4，稳定性和保质期都较好，但需要在溶液中添加抗氧化剂如DTT来维持蛋白的还原性。 Tris-Acetate凝胶的pH为7，跑大分子蛋白时分辨率很高。推荐使用Tris-Acetate凝胶！梯度浓度很重要 𐟓ˆ 凝胶浓度与孔径成反比：浓度越小，孔越大。较大的蛋白质更容易通过较大的孔。建议使用低百分比的凝胶，如7%。可以使用梯度凝胶，尤其适合新样本。虽然制作梯度凝胶较为棘手，需要梯度凝胶装置，但现在许多公司出售具有不同范围的预倾倒梯度凝胶，大大节省了时间。调整转移buffer 𐟔„ 转移buffer的组成至关重要。甲醇的存在会使大分子蛋白沉淀。通过减少转移buffer中的甲醇百分比（10%或更低）来避免这种情况发生。为了进一步确保蛋白质不会沉淀，可以添加SDS至终浓度为0.1%。SDS向蛋白添加均匀的负电荷，使得它们更容易从凝胶转移到膜上。选择合适的膜 𐟧ꊨ†œ一般有PVDF膜或NC膜，跑大分子蛋白选择PVDF膜。PVDF膜不需要在转移buffer中添加甲醇，目的蛋白转印的机会更高。增加转印时间 ⏳ 在正确的选择完凝胶、转印膜及转移buffer后，转印正式开始。半干转快且方便，但不适用于大分子蛋白。推荐使用湿转，因为大分子蛋白转移时间很慢，推荐350-400 mA转移90min或4Ⰳ，40 mA，转印过夜。通过以上五个步骤，你可以更好地跑出漂亮的大分子蛋白WB图！

SDS-PAGE电泳技术常见问题解答 𐟧접: SDS-PAGE电泳的基本原理是什么？ A: SDS-PAGE利用SDS分子与蛋白质结合，使蛋白质带负电。蛋白质-SDS复合物在凝胶中根据分子量大小分离。蛋白质的迁移率与其分子量成正比。 𐟧ꠑ: 缓冲液系统对电泳有何影响？ A: 制备凝胶时使用Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶pH为6.7，分离胶pH为8.9。在浓缩胶的弱酸性环境下，蛋白质聚集成狭窄区带，进入碱性分离胶时根据大小分离。 𐟔 Q: 样品应如何处理？ A: 有三种处理方法：还原SDS处理：加入SDS和DTT后，蛋白质结构被解开，形成SDS-蛋白质复合物。带烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺烷基化保护SH基团，防止银染纹理现象。非还原SDS处理：生理样品直接用SDS沸水煮，不加还原剂。 𐟌 Q: SDS-PAGE凝胶中各成分的作用是什么？ A: 聚丙烯酰胺为载体，TEMED和AP促进凝胶凝固。SDS作为去污剂，去除蛋白质电荷，解离氢键。 𐟒᠑: 如何提高SDS-PAGE电泳分辨率？ A: 确保凝胶充分聚合，室温保存凝胶，避免立即使用或冷藏。选择合适的染色方法。 𐟘Š Q: “微笑”形带的原因及处理方法是什么？ A: 凝胶中间部分凝固不均，常见于厚凝胶。处理方法：确保充分凝固。 𐟙 Q: “皱眉”形带的原因及处理方法是什么？ A: 电泳槽间气泡未排除。处理方法：加入缓冲液排气泡。 𐟌€ Q: 拖尾现象的原因及处理方法是什么？ A: 样品未充分溶解或分离胶浓度过高。处理方法：离心样品，选择合适的样品缓冲液。 𐟔𕠑: 溴酚蓝无指示作用的原因及处理方法是什么？ A: 缓冲液和凝胶浓度影响。处理方法：更换正确pH的Buffer，调整凝胶浓度。 𐟑𛠑: “鬼带”现象的原因及处理方法是什么？ A: 还原剂氧化失活导致蛋白质重折叠。处理方法：加热后添加DTT或EDTA。 ⚡ Q: 高电压低电流的原因及处理方法是什么？ A: 电泳槽装配不当。处理方法：确保正确装配。

实验室有毒试剂清单｜珍爱生命，远离实验昨天在实验室搞多聚甲醛的时候，没在通风橱里操作，结果今早起来头巨痛！真是教训啊，大家做实验一定要戴好口罩，做好防护！立马整理了一下实验室里的有毒试剂，绝不做实验室的牺牲品！ DMSO（二甲基亚砜）𐟧ꊨ🙤𘪤𘜨忧”褺Ž冻存液的配置，还有作为常见粉剂的溶剂。但它有血管毒性和肝肾毒性，小心为上！ EB（溴化乙锭）𐟒€ EB用于琼脂糖凝胶电泳的核酸染料，剧毒！我们学校仪器平台都不让用EB显影，致癌性很强，大家一定要小心。 PCR实验𐟧슥šPCR实验的时候，苯、二甲苯、酚、trizol、氯仿这些有机溶剂都是致癌的。还有DEPC（焦炭酸二乙酯），用于溶解RNA，但它是潜在的蛋白质变质剂。做PCR一定要戴好口罩！ WB实验𐟓Š WB实验中，PMSF用于蛋白提取，高强度毒性；SDS（十二烷基硫酸钠）用于SDS-PAGE电泳凝胶配置，有刺激作用，可能引起呼吸系统过敏性反应；丙烯酰胺（未聚合）是蛋白电泳凝胶原料，有潜在神经毒性；TEMED（四甲基乙二胺）用于SDS-PAGE凝胶配置，催化凝胶凝固，但易挥发，强神经毒性。 Triton x-100𐟧𔊨🙤𘪤𘜨忦œ‰刺激性，可以因吸入或皮肤吸收受害，大家要小心。多聚甲醛𐟕𕯸‍♂️ 多聚甲醛用于组织固定灌流，易挥发且剧毒。昨天我就是因为这个倒霉东西头才这么痛的。 DTT (二硫苏糖醇)𐟧ꊥ𐏥ˆ†子有机还原剂，散发出难闻的气味。可以因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。吉姆萨 Giemsa𐟦 吉姆萨染料有极强的毒性，可致命或引起眼睛失明。可以通过吸入和皮肤吸收，其可能的危险是不可逆的效应。过硫酸铵 APS𐟒动🇧᫩…𘩓𕥯𙩻膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大危害性。吸入可致命。甲醇𐟍𖊧”𒩆‡有毒，致命剂量大约是70毫升。甲醇的毒性对人体的神经系统和血液系统影响最大。它经消化道、呼吸道或皮肤摄入都会产生毒性反应，甲醇蒸汽能损害人的呼吸道粘膜和视力。佩戴好防毒面具和护目镜，避免接触其蒸汽，注意在通风橱内操作。乙醚𐟔劤𙙩†š高度挥发，遇明火、高热极易燃烧爆炸，并有特殊气味。化学性质不稳定，日光下去空气接触，易形成爆炸性过氧化物过氧化乙醚。应小心使用。广泛用作麻醉剂。希望大家在做实验的时候一定要注意安全，珍爱生命！

自制蛋白上样缓冲液，WB实验更稳定！自从进入实验室，我发现大部分实验试剂都是自己配置的，尤其是Western blot实验的一整套试剂，从头到尾都是自配的，非常稳定，实用效果非常好！今天就来分享一下如何配置各种蛋白上样缓冲液。 5xNative-PAGE Loading Buffer 𐟌🊥œ訿›行天然蛋白的研究分析时，需要使用非变性的蛋白上样缓冲液来处理样品，以保持蛋白的天然活性。相比变性的蛋白上样缓冲液，它不添加去垢剂和还原剂。以下是5xNative-PAGE Loading Buffer的配方（10 mL）： 0.25M Tris-HCL (pH 6.8) - 1M Tris-HCL (pH 6.8) 2.5mL 溴酚蓝 (BPB) - 0.5%（WM）0.05g 甘油 - 50%（WM）5mL dH₂O - 2.5mL 配置步骤：将所有组分混合均匀。室温或不超过37℃的水浴中溶解非变性蛋白，然后立即放置室温，尽量避免长时间水浴。各组分的作用 𐟔 十二烷基硫酸钠 (SDS)：破坏蛋白质的二级和三级结构，使其去折叠，覆盖蛋白质本身的电荷，赋予蛋白质净负电荷。同时与硫醇试剂一起使蛋白质线性化，电泳时蛋白质的分离只与分子大小有关。还原剂：如巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），用于减少含硫氨基酸（如半胱氨酸）之间产生的二硫键。此外，由于硫醇剂具有抗氧化特性，能够防止半胱氨酸的氧化。与SDS发挥协同作用，使蛋白质线性化。甘油：增加样品的密度，发挥样品沉降作用。 Tris-HCL：维持pH在6.8左右，防止在低温保存的过程中蛋白质肽键断裂，保证了蛋白质的稳定性；同时，Tris可以抑制酶促反应并防止蛋白酶降解蛋白质。溴酚蓝：指示样品在凝胶中的位置。自制蛋白上样缓冲液不仅稳定，而且可以根据实验需求进行调整，确保实验结果的准确性。希望这些配方和步骤对你有所帮助！

内参双条带在进行Western Blot（WB）实验时，内参actin出现两条带的现象可能让许多研究者感到困惑。以下是一些可能的原因及解决方法，帮助你更好地理解这一现象： actin的降解𐟌€ actin是细胞骨架的主要成分，分子量为42 kDa。在细胞凋亡过程中，actin可能会被降解，形成38-41kDa的片段。这种降解可能会导致在WB实验中出现两条带。 IL-1š„切割𐟔ꊠ 有研究表明，IL-1ƒ𝥤Ÿ切割actin。如果你的实验中IL-1𐴥𙳨𞃩똯𜌥糖𝤼š观察到两条带。这种情况下，需要具体分析实验条件，确认是否有IL-1š„激活。非特异性结合𐟔— 多克隆抗体的非特异性结合也可能导致两条带的出现。这种情况下，两条带的强度可能不同。尝试通过反复使用WB来消耗掉非特异结合，或者降低抗体稀释度（例如从1:500到1:2000或1:5000）。电泳液和转膜液pH异常𐟌᯸ 电泳液和转膜液的pH值异常也是导致actin出现两条带的原因之一。确保所有溶液的pH值严格控制，可以解决这个问题。曝光时载物台移动𐟓𘊠 在曝光过程中，如果载物台不平或者ECL显影液覆盖膜，可能会导致膜随着液体流动，从而产生两条带。二硫键的存在𐟔— 在某些情况下，细胞裂解液中使用的巯基乙醇可能无法完全破坏二硫键，导致actin出现两条带。这种情况下，可以在细胞裂解液中加入10mM的DTT来解决。其他原因𐟔 抗体浓度过高、孵育温度过高或孵育时间过长也可能导致actin出现两条带。尝试调整这些条件，看看是否能解决问题。通过以上方法，你应该能够找到actin出现两条带的原因，并采取相应的措施来解决这个问题。

实验室毒物大揭秘！𐟔𐟒€ 实验室里，那些看似神奇的化学试剂，其实隐藏着不小的危险。今天，我们就来聊聊那些让人闻风丧胆的有毒试剂。 DMSO（二甲基亚砜）𐟧ꊄMSO常用于冻存液的配置，也是许多粉剂的溶剂。然而，它具有血管毒性和肝肾毒性，使用时一定要小心。 EB（溴化乙锭）𐟧슅B是琼脂糖凝胶电泳中的核酸染料，具有致癌性。在我们学校的仪器平台，使用EB时甚至不允许显影，因其毒性极强。 PCR实验中的有毒试剂𐟧𜊐CR实验中使用的苯、二甲苯、酚、trizol、氯仿等有机溶剂都有致癌风险。DEPC（焦炭酸二乙酯）用于溶解RNA，是潜在的蛋白质变质剂。进行PCR实验时一定要戴好口罩。 WB实验中的危险试剂𐟧ꊗB实验中使用的PMSF用于蛋白提取，具有高强度毒性；SDS（十二烷基硫酸钠）用于SDS-PAGE电泳凝胶配置，具有刺激作用，可能引起呼吸系统过敏性反应；丙烯酰胺（未聚合）作为蛋白电泳凝胶原料，具有潜在神经毒性；TEMED（四甲基乙二胺）用于SDS-PAGE凝胶配置，能催化凝胶凝固，易挥发，且具有强神经毒性。 Triton x-100𐟧𔊔riton x-100具有刺激性，可能因吸入或者皮肤吸收而使人受害。多聚甲醛𐟧ꊥ䚨š甲醛应用于组织固定灌流，易挥发且属于剧毒物质。 DTT (二硫苏糖醇)𐟧ꊄTT是一种小分子有机还原剂，会散发出难闻的气味。可能因吸入、咽下或者皮肤吸收而危害健康。吉姆萨 Giemsa𐟧ꊥ‰姆萨染料毒性极强，可能致命或者导致眼睛失明，能够通过吸入和皮肤吸收进入人体，其可能造成的危险具有不可逆的效应。过硫酸铵APS𐟧ꊨ🇧᫩…𘩓𕥯𙤺Ž黏膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤具有极大的危害性。吸入甚至可能致命。甲醇𐟍𗊧”𒩆‡有毒性，致命剂量约为70毫升。甲醇的毒性对人体的神经系统和血液系统影响最为显著，不论是经消化道、呼吸道还是皮肤摄入，都会产生毒性反应。甲醇蒸汽会损害人的呼吸道粘膜和视力。因此，要佩戴好防毒面具和护目镜，避免接触其蒸汽，并注意在通风橱内进行操作。乙醚𐟧ꊤ𙙩†š是一种高度挥发，遇明火、高热极易燃烧爆炸，并具有特殊气味的液体。其化学性质不稳定，在日光下与空气接触，易形成爆炸性过氧化物过氧化乙醚。使用时应倍加小心。乙醚广泛用作麻醉剂。 𐟌Ÿ进入实验室时，一定要严格遵守安全规定，戴好防护用具，手套、护目镜一个都不能少！𐟒–生命只有一次，千万不能掉以轻心！让我们一起远离危险，保护好自己！

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