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反向PCR前沿信息_反向pcr测定未知dna区域又为啥要先环化再扩增测序?不能直接测吗(2024年12月实时热点)

内容来源：麦吉窗影视所属栏目：教程更新日期：2024-11-30

反向PCR

两款引物设计神器，轻松搞定！引物设计是分子生物学实验的关键步骤，选择合适的软件可以大大提高工作效率。以下是两款简单易用的引物设计软件，帮助你轻松搞定引物设计。 𐟔砓napGene SnapGene是一款功能强大的引物设计软件，特别适合初学者。它支持同源重组引物设计，步骤如下：载体线化：通过酶切或反向PCR方法将载体线性化。同源臂碱基：根据酶切位点选择合适的同源臂长度，注意顶部链直接复制，底部链选择5端到3端的序列。复制顶部链碱基：直接复制顶部链的碱基序列。复制底部链碱基：复制底部链的碱基序列。复制氨基酸：根据需要复制相应的氨基酸序列。复制图谱：生成引物设计的图谱。 𐟌 NCBI NCBI是另一款广受欢迎的引物设计软件，操作简单，功能全面。你可以根据自己的需求选择合适的引物设计方法，轻松完成引物设计。这两款软件各有特色，大家可以根据自己的喜好和需求选择学习。当然，如果你想要更全面的功能，不妨两款都试试，毕竟小孩子才做选择，大人当然是全都要！𐟘‰

𐟧쳲-无缝克隆操作指南 𐟔젤𘺤𚆦升克隆效率并减少突变，推荐使用高保真PCR Mix来扩增DNA。同时，预线性化的质粒作为模板是更好的选择哦！ 𐟓 引物设计小技巧： - PCR引物的5'端，要包含与相邻片段同源的15-25nt序列，推荐18nt，确保扩增产物能与相邻片段形成重叠。 𐟓 插入片段的引物设计如下： - 正向扩增引物：5'端是上游载体末端的正向同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列。 - 反向扩增引物：3'端是基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端的反向同源序列。 𐟒ᠨ𝽤𝓤𘎦’入片段的用量建议： - 最适载体用量（ng）= 0.02 㗠载体碱基对数。 - 最适片段用量（ng）= 0.04 㗠片段碱基对数（单片段）；0.02 㗠片段碱基对数（多片段）。 - 若插入片段太长，则建议增加载体用量。 - 若插入片段太短，则建议增加片段用量至5倍。 𐟔堤𝓧𓻥应步骤来啦： 1️⃣ 轻轻混匀各组分，避免气泡产生。 2️⃣ 将反应体系置于50℃，反应5-60分钟。 3️⃣ 反应后置于冰上冷却，然后进行转化或储存于-20℃。 ⏰ 反应时间小贴士： - 插入1-2个片段时，推荐5-10分钟。 - 插入3-5个片段时，推荐15-30分钟。 - 当载体骨架或插入片段总长超过特定值时，建议延长至30-60分钟。 𐟒ᠦœ€后，记得在50℃反应后进行瞬时离心，确保反应液收集至管底哦！

QuikChange法突变，详解！ QuikChange法适用于点突变（或相邻多个位点突变）、基因删除、小片段基因插入或替换。虽然其他步骤相同，但引物设计略有差异。以下是详细原理和操作方法：简要原理 𐟓œ QuikChange法相当于对整个质粒进行PCR（环P）。利用带有反向互补序列的引物，将整个质粒进行PCR扩增。PCR过程中，质粒形成环状，转化大肠杆菌后缺口被修补。实验方法 𐟧ꊤ𛥥Œ链质粒为模板进行PCR扩增（PCR退火温度根据引物确定，延伸时间根据整个质粒长度及DNA聚合酶确定）。模板量可以减少到1-5ng/50，循环数可减少至25-28个。 PCR条件示例 𐟔効5℃，5min，1循环 95℃，30s 60℃，30s 72℃，4min，25循环 72℃，10min，1循环 PCR后最好先跑胶确认有没有条带。虽然有很多人说PCR后没有条带也正常，转化依然可以长出菌落，但个人经验：如果无条带或者条带弥散，转化大概率不会长。 Dpn酶切 𐟔ꊦ‰饢ž产物用Dpn酶切去除甲基化的质粒模板。Dpn酶切条件示例： 10㗢uffer：2 DpnI：1 37℃孵育2小时。转化与验证 𐟧슥𐆩…𖥈‡后的产物转化DH5a/Top10感受态细胞，进行菌落PCR和测序验证。详细原理 𐟔스𛥨𔨧𒒄NA作为模板，在高保真聚合酶作用下，使用两条具有同源序列的引物引导DNA合成。两条引物内均含有预定突变位点，经过多轮热循环，双链质粒DNA的全长均以线性形式扩增。由于引物含有同源序列，最终产生DNA双链带交错缺口的突变质粒。经过高保真酶扩增而得到的DNA产物具有缺口，DNA链的磷酸二酯键并未闭合，非闭合环形质粒同样也能被大肠杆菌细胞吸收，断裂的缺口可在质粒进入感受态细胞内后被修补。甲基化修饰 𐟧ꊥŽŸ来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpnl敏感而被切开（Dpnl识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次）。而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。通过以上步骤，你就可以成功设计并操作QuikChange法突变引物啦！

师姐的实验记录本：移液操作的关键技巧最近翻了翻师姐的实验记录本，真是大开眼界！原来不同的实验，移液的操作要点差别这么大。细胞培养、PCR实验、ELISA实验，每种实验都有自己独特的移液技巧。细胞培养：均匀、快速接种，注意剪切力 𐟧슥œ觻†胞培养中，移液的关键是均匀和快速。接种细胞时，要确保每块培养皿的细胞数量一致，这样才能保证实验结果的可靠性。同时，也要注意避免产生过多的剪切力，以免损伤细胞。 PCR实验：预润洗、吸头吸附力、正向移液与反向移液 𐟧슐CR实验对移液的要求特别高。首先，要进行预润洗，确保吸头内没有杂质。其次，吸头的吸附力要强，这样才能避免移液时液体泄漏。最后，正向移液和反向移液的操作要熟练，这样才能保证PCR反应的准确性。 ELISA实验：精确加样、温度控制 𐟧슥œ腌ISA实验中，精确加样是关键。每一步都要严格按照实验要求进行，确保样品的量准确无误。同时，温度控制也非常重要，过高的温度会影响酶的活性，从而影响实验结果。移液器常见问题及解决方法 𐟛 ️ 移液器滴液：建议采用反向移液的方法，或者使用外置活塞原理的移液器。移液器漏吸：使用同一品牌的移液器和吸头匹配，这样可以减少漏吸的发生。移液器吸不准：要注意吸液时保持移液器垂直，这样可以避免吸不准的问题。移液时产生气泡：可以采用反向移液技术：吸取液体时，将排液按钮按至第二档，吸头浸入液面至少1mm，吸取液体。真是后悔没有早点看到师姐的记录本，这些小技巧真的让我受益匪浅！希望大家也能从中学到一些有用的知识，提升自己的实验技能。

𐟧쐃R引物设计全攻略✨ 𐟔 引物，这段单链DNA或RNA，是PCR实验中的关键！好的引物设计，能让你的实验成功率大大提升哦！ 𐟓 引物设计，其实并不难，只要掌握几个基本原则： 1️⃣ 长度：18-30bp之间，常用18-27bp，别太长也别太短哦！ 2️⃣ GC含量：40%-60%，最好高于50%，这样引物在退火时就能更稳定地结合。 3️⃣ Tm值：50-65℃，正反向引物的Tm值要相近，差异不能太大。 4️⃣ 特异性：引物只与目标序列结合，避免非特异性扩增。 𐟚련😦œ‰几点要注意，避免引物之间形成二聚体、发夹结构等，这些都可能影响PCR反应的成功。 𐟒ᠥ𘸧”襼•物设计软件有Primer Premier、Oligo等，设计完成后还可以用BLAST检查引物的特异性。 𐟎‰ 现在，你是不是对PCR引物设计有了更深的了解呢？快去试试吧！

𐟒Š 战胜HPV：红卡治疗的奇迹之旅 𐟌𙊩⥯𙈐V16阳性的低度病变，我们当地的医生建议直接进行锥切手术。然而，我并不想轻易放弃，于是前往齐鲁医院寻求更温和的治疗方案。医院主任推荐了激光联合红卡的治疗方法。 3月份，我接受了激光治疗。一个月后，我按照医生的建议去复查。由于HPV16是高危型中的高危型，我向主任询问了最佳的治疗方案。主任解释说，红卡没有副作用，转阴率高，但需要隔一天使用一次，共二十天。虽然上药过程很快，只需半个小时，但坚持使用四个月后复查，我终于等到了转阴的结果。那一刻，我激动得几乎要流泪𐟘�˜�˜�‚ 红卡，这种外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架，通过PCR-反向斑点杂交法进行检测。HPV核酸检测是宫颈癌筛查的重要辅助手段。如果HPV阴性，建议一年后复诊；如果仍为阴性，复诊间隔可以延长至3-5年。对于HPV阳性者，建议进行细胞学检测。如果细胞学检测结果正常，每年跟踪随诊一次；如果结果异常，请咨询医生进行进一步的诊断与治疗。 HPV感染在育龄期妇女中较为常见，高危型HPV人群感染率约为20-30%。HPV感染分为暂时性和持续性感染。只有一小部分感染是持续性的，是否持续感染与感染型别、年龄、免疫功能等因素有关。高危型HPV的持续感染是引起宫颈癌和癌前病变的主要原因；而低危型HPV的感染能引起宫颈上皮低度病变和良性湿疣。通过红卡治疗，我成功地逆转了HPV16阳性的低度病变，体验到了治疗的奇迹。

如何轻松实现无缝克隆？ 𐟔젤𘺤𚆥œ襅‹隆过程中减少突变的引入，推荐使用高保真PCR Mix进行扩增，并使用预线性化的质粒作为模板，这样可以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。 𐟓 引物设计原则： PCR引物的5'端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25nt（推荐18nt）序列，以确保扩增产物的5'端和3'端分别与相邻片段形成重叠序列。 𐟔砦’入片段的引物设计：正向扩增引物：5'—上游载体末端正向同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列—3’ 反向扩增引物：3‘—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端反向同源序列—5’ 𐟔砨𝽤𝓤𘎦’入片段、插入片段与片段连接处引物、载体反向扩增引物的设计：最适载体用量（ng）= 0.02 㗠载体碱基对数，即0.03 pmol（单片段、多片段适用）最适片段用量（ng）= 0.04 㗠片段碱基对数（单片段）；最适片段用量（ng）= 0.02 㗠片段碱基对数（多片段）单片段重组反应，若单个插入片段的长度大于载体，则应将载体与插入片段的计算公式互换单片段重组反应，若单个插入片段的长度小于200bp，则插入片段应使用5倍的用量多片段重组反应，各个插入片段的用量应不少于10ng，使用上述公式计算最适使用量低于此值时，直接使用10ng 若按上述公式计算出的线性化载体用量低于50ng或高于200ng，建议按50ng或200ng用量使用线性化载体过长，插入片段过长或片段数过多，克隆阳性率均会降低。 𐟧ꠤ𝓧𓻥应：配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。将反应体系置于50℃，反应5~60min。将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20℃。推荐使用PCR仪等温控精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低。插入1~2个片段时，推荐反应时间为5~15min；插入3~5个片段时，推荐反应时间为15~30min。当载体骨架在10kb以上或插入片段总长在4kb以上时，推荐延长反应时间至30~60min。建议在50℃反应完成后进行瞬时离心，将反应液收集至管底。 -20℃储存的重组产物，建议1周内使用完毕。

𐟧챐CR实验步骤全解析𐟔 𐟔奏˜性阶段𐟔导š 将反应混合物加热至94℃，DNA双链间的氢键会断裂，形成单链DNA，为后续的合成提供模板。 𐟌᯸退火阶段𐟌᯸：温度降至54-60℃，引物附着在模板DNA的互补序列上。这两个引物——正向和反向——将引导DNA的合成。 𐟒ꥻ𖤼𘩘𖦮𕰟’꯼š 温度升高至72-80℃，Taq聚合酶将碱基固定到引物的3'末端，从5'延伸至3'，合成新的DNA链。 𐟤–PCR仪操作流程𐟤–： 1️⃣ 使用PCR仪加热样品，使DNA变性并分离成单链。 2️⃣ 利用“Taq聚合酶”以旧链为模板创建新链。 3️⃣ 原始DNA被复制，每个新分子包含一条旧链和一条新链。 4️⃣ 变性和新DNA合成的循环重复30-40次，产生大量DNA副本。 5️⃣ 整个PCR过程自动化，由热循环仪控制温度变化，实现DNA的变性和合成。𐟔„ 通过这些步骤，我们能够高效地复制和检测DNA，为科研提供有力支持！𐟒ꢜ耀

北京飞多伦多：入境隔离全攻略终于成功“反向跑毒”啦！这次分享一下从北京飞多伦多的入境准备材料和隔离酒店的全攻略，希望对大家有帮助。入境准备材料𐟓‹ 72小时内的核酸检测报告（中英文对照）：报告上要有姓名、出生年月日、测试时间、检测机构名字和地址、检测方法（PCR或LAMP）以及检测结果。我是在济南做的检测，选择了迪安检测，费用150RMB，可以加出生日期和护照号码。早上9点多做的检测，下午3:30左右就出结果了，当天一定出结果哦！出了报告后，一定要仔细检查所有信息。我的出生日期一开始被工作人员搞错了，幸好赶在他们下班前修正过来了！ Book酒店：现在可以直接在网上预订，不需要打电话，方便很多。记得留好Confirmation。 ArriveCan Receipt：提前下载ArriveCan app，按照步骤填写，拿到一个Code，可以截屏保存，也可以登录App查看。注册SwitchHealth账号：可以提前扫二维码注册SwitchHealth账号，用于落地加拿大后的核酸检测。 PR和公民：入境时只需带好以上资料和PR卡以及护照。学签和工签的小伙伴需要上官网查一下具体要携带的资料。出入境流程✈️ 我乘坐的是海航HU7975。先托运行李，检查所有资料，确保可以登机。超过重量的行李收费580RMB。然后会给你发一张表格，可以在出海关时旁边的小桌子上填写。之后过完安检就可以候机了。⚠️我随身携带的小瓶75%酒精凝露和湿巾都被没收了，不让带上飞机。落地加拿大后，入海关前要在机器上自动申报。之后海关检查资料，入关，取行李。取完行李会先让你去拿自己的检测试剂瓶等，这里需要提前注册Switch Health，给工作人员报电话号码就可以了。然后再往前走去小隔间做检测，左右两边鼻子各转15秒，虽然不深但时间太久了，太煎熬了！之后流程结束，就可以去酒店啦！隔离酒店𐟏芊我选择了最方便的Sheraton Gateway。做完检测电梯上2楼，走到Currency Exchange附近的电梯上3楼，按照路标走就找到啦。超级方便！可以一直推着小推车。酒店房间够宽敞，卫生感觉做得也可以。我用消毒酒精重新自己擦了一遍以防万一。第一次感受国际机场空空如也，什么都不用排队。在下飞机前可以穿好防护服，愿大家顺利平安落地加拿大！希望这些信息对大家有帮助，祝大家旅途愉快！

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